液相色譜儀分離的目的必須十分明確，下面的問題在建立方法之初就應(yīng)確定： ?。?）主要目的是什么？定量或定性，還是定性、定量同時做？； ?。?）是否有必要解析出樣品的所有成分？譬如可能有必要分離出產(chǎn)品中的所有降解物或雜質(zhì)，以使含量測定結(jié)果更加可靠，但卻沒必要將它們彼此完全分開?！ 。?）如要求定量分析，準(zhǔn)確度與精密度需多大？樣品主要成分的精密度通常能達(dá)到±1—2%，特別是不需樣品預(yù)處理的情況。 ?。?）特殊化合物可能會以不同的樣品形式出現(xiàn)（如：原料藥，一種或多種形態(tài)，環(huán)保樣品等）。是否需要一種以上的HPLC方法？單一方法分離不同形態(tài)樣品是否理想？ ?。?）一次將分析多少樣品？當(dāng)必須同時處理大量樣品時，運行時間將變得非常重要?！ ∮袝r甚至為了縮短運行時間而以犧牲樣品分離度作代價，如縮短柱長或加快流速。當(dāng)一次分析的樣品數(shù)目超過10個，運行時間一般應(yīng)控制在20min以內(nèi)。 ?。?）將要使用該方法的實驗室中，有哪些HPLC設(shè)備？色譜柱能否恒溫系統(tǒng)能否做梯度洗脫？該方法是否可在不同設(shè)計與生產(chǎn)的設(shè)備上運行？ 方法建立實驗開始之前，應(yīng)明確對方法的這些要求。
一、流動池內(nèi)有氣泡：
如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動池，將使噪音增大。如果氣泡較大，會在基線上出現(xiàn)許多線狀峰。這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對流動相進行充分的除氣，檢查整個色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。
二、流動池被污染：
無論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移，要注意溶劑的互溶性。如果污染嚴(yán)重，需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或取出池體進行清洗，或更換窗口。
三、光源燈出現(xiàn)故障：
紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時，可能產(chǎn)生嚴(yán)重噪音，基線漂移，出現(xiàn)平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零，這時需要更換光源燈。
四、倒峰：
倒峰的出現(xiàn)可能是檢測器的極性接反，改正后即可變成正峰。
用示差折光檢測器時，如果組分的折光指數(shù)低于流動相的折光指數(shù)，會出現(xiàn)倒峰，需要選擇合適的流動相。
如果流動相中含有紫外吸收的雜質(zhì)，使用紫外檢測器時，無吸收的組分會產(chǎn)生倒峰，因此，必須用高純度的溶劑作流動相。
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