不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補充流動相，泵將溶劑瓶中的流動相吸干了，HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實上，如果泵將溶劑瓶中的流動相吸干，并不會造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會將空氣排入色譜柱。因為泵只能輸送液體，而不能輸送空氣。相比之下，另一個更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣，整個色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生，多半可能只是色譜柱兩端的幾個毫米變干了，因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當長的時間。即使色譜柱真的變干了，也不一定就不可救藥了?？梢試L試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑(如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇)沖洗色譜柱以除去氣體。較低的表面張力有助于浸潤填料表面；已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要(以1mL/min的流速)沖一個小時或更多的時間被徹底浸潤，恢復(fù)到正常狀態(tài)。
2. 使用PEEK(polyetheretherketone)管路和接頭需要注意什么問題？
如果經(jīng)常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用PEEK材料制成的管路和接頭會非常方便。PEEK管路容易連接；PEEK接頭不僅無需工具，手擰即可固定，而且容易調(diào)節(jié)錐箍之外的管路長度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。
使用此類材料的管路需要注意的是：PEEK對鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解PEEK材料的明顯跡象，但PEEK遇到上述溶劑會變脆。另一個西藥考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但PEEK管只能耐受近4000psi(但多數(shù)HPLC應(yīng)用系統(tǒng)壓力不會超過3000psi)。
使用PEEK接頭時則無需擔(dān)心接頭耐溶劑性能，因為接頭幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手擰固定的PEEK接頭壓力限低于不銹鋼管，因而壓力太高時，可能會使接頭在管路上滑動而產(chǎn)生死體積或漏液。
3. 如何預(yù)防液相泵的故障:
要保持泵的良好操作性能,必須維護系統(tǒng)的清潔,保證溶劑和試劑的質(zhì)量,對流動相進行過濾和脫氣.下面列出預(yù)防泵故障的幾項措施:
1)、用高質(zhì)量試劑和HPLC級溶劑；
2)、過濾流動相和溶劑；
3)、脫氣；
4)、每天開始使用時放空排氣，工作結(jié)束后從泵中洗去緩沖液；
5)、不讓水或腐蝕性溶劑滯留泵中；
6)、定期更換墊圈；
7)、需要時加潤滑油；
8)、查閱有關(guān)泵操作手冊中的其它建議。
處于良好操作狀態(tài)的泵，應(yīng)該能使色譜圖上的基線平穩(wěn)；保留時間的重復(fù)性好。在等度洗脫時壓力波動小于2%。梯度洗脫時壓力變化應(yīng)是緩慢和平穩(wěn)的。
為了使故障發(fā)生后盡快排除，平時應(yīng)常備密封、單向閥(入口與出口)、泵頭裝置、各式接頭、保險絲等部件，以及更換工具。
高效液相色譜和氣相色譜在基本理論方面沒有顯著不同，它們之間的重大差別在于作為流動相的液體與氣體之間的性質(zhì)的差別。
高效液相色譜分析原理：
一、高效液相色譜分析的流程：由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測量之后，導(dǎo)入進樣器。被測物由進樣器注入，并隨流動相通過色譜柱，在柱上進行分離后進入檢測器，檢測信號由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離極性范圍比較寬、還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動相極性，使樣品各組分在較好條件下得以分離。
二、高效液相色譜的分離過程：同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。
二、高效液相色譜的分離過程：同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。
開始樣品加在柱頭上，假設(shè)樣品中含有3個組分，A、B和C，隨流動相一起進入色譜柱，開始在固定相和流動相之間進行分配。分配系數(shù)小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯留時間長，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A，C之間，第二個流出色譜柱。若一個含有多個組分的混合物進入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達到分離之目的。
不同組分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問題，也是分離的首要條件。其次，當不同組分在色譜柱中運動時，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關(guān)。所以分離最終效果則是熱力學(xué)與動力學(xué)兩方面的綜合效益。
1、流動相的抽濾要求
色譜純試劑，二次蒸餾水，緩沖鹽一定要過濾。
2、吸濾頭
特殊情況下可拆下濾頭抽取以判斷其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流動相通過吸濾頭打出以判斷其是否堵塞。若有堵塞情況可用異丙醇超聲波清洗；清洗不成功則需要更換。
3、單向閥
如遇到泵壓不穩(wěn)或流動相不能抽取，則可能是單向閥出現(xiàn)問題，卸下用異丙醇超聲波清洗，清洗時須按其安裝的反相放置在小燒杯中，切記不可與安裝方向倒置超洗！
4、泵頭
泵頭漏液或出現(xiàn)其它故障一般要申請維修(如漏液，或更換柱塞桿及其密封墊等)。
5、過濾片
當色譜峰出現(xiàn)異常情況時，有可能是此部件被污染，拆下用異丙醇超洗或更換過濾墊片。
6、排液閥
此處不能完全密封或漏液時一般是其中的墊片污染或磨損，可卸下后取出其墊片用異丙醇超聲波清洗或更換墊圈。
7、手動進樣器
平時應(yīng)注意用二次蒸餾水和甲醇在裝載狀態(tài)及進樣分析狀態(tài)清洗；如出現(xiàn)漏液現(xiàn)象，原因極可能為轉(zhuǎn)子密封墊磨損或污染，一般須申請維修或更換配件。
8、流通池
在色譜峰不正常時可能是此部件被污染可拆卸后取出其中的墊片用異丙醇超洗(可根據(jù)說明書進行操作或申請維修)。
9、工作站
出現(xiàn)死機可重啟計算機；不正常運行時，首先可更換電腦測試其硬件故障；或在本機上重新插撥接口、重新安裝軟件。
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