高效液相色譜柱的故障分析

色譜柱是有使用壽命的。一根正常的商品柱一般可以正常使用2000~5000次進(jìn)樣；保護(hù)良好的柱子可達(dá)10000次以上，但是有時候即使是一次不當(dāng)使用就可能使柱子發(fā)生嚴(yán)重的損害。柱子受損害后，可表現(xiàn)為柱壓升高、柱效下降、峰形異常等現(xiàn)象。

          1. 柱壓升高

           造成柱壓升高的可能原因有很多。一般是由于柱床內(nèi)產(chǎn)生了異常的占位性物體，造成流體阻力加大所引起的。

          （1）流動相過濾不良        這往往是由于流動相沒有過濾，或者雖然已經(jīng)過濾但濾膜孔徑過大或濾片損壞，使得固體雜質(zhì)滯留于濾板上所造成的。致使柱的進(jìn)口濾片處堵塞，壓力升高。

          （2）霉菌生長      霉菌在流動相中、管路中或柱子進(jìn)口處繁殖、生長，堵塞濾板，導(dǎo)致壓力升高。這種現(xiàn)象在夏天，尤其是使用磷酸鹽緩沖液為流動相時更易發(fā)生。在夏季使用磷酸鹽緩沖液時一般要現(xiàn)配現(xiàn)用。即使保存在冰箱中，一般也不要超過兩天。否則，即使不堵塞濾板，也會因細(xì)菌或霉菌孳生而產(chǎn)生的代謝物造成對樣品的干擾。

          （3）非特異性吸附      當(dāng)溶質(zhì)在柱子上有較強的非特異性吸附，且當(dāng)前所用的流動相難以將它們洗脫時，累積的未洗脫溶質(zhì)也會造成阻力增大和壓力升高。

          （4）更換流動相時置換不徹底      致使流動相不互溶

          （5）鹽晶體的析出       更換流動相后，緩沖液在新的流動相體系溶解度低而析出

          （6）樣品的沉淀      配制樣品的溶劑與流動相不一致時，樣品進(jìn)入柱中溶解度可能降低而析出

          （7）壓力脈沖      運行過程中，有時會產(chǎn)生系統(tǒng)內(nèi)壓力的突然升降。如，轉(zhuǎn)動進(jìn)樣閥時動作過緩，造成液流堵塞再瞬間釋放；開機瞬間壓差較高等。壓力脈沖會造成多孔填料的崩壞和柱床結(jié)構(gòu)的微小變化。填料微屑的長期累積可能會使柱床阻力增大。

          2.  柱效下降

           柱子在使用過程中分離性能逐步降低是正?，F(xiàn)象。但是如果發(fā)生突然降低或改變，屬于異常現(xiàn)象。此時，應(yīng)分析原因，有針對的采取措施，避免這種情況發(fā)生，或及時進(jìn)行柱子再生，以求盡可能地恢復(fù)其性能。造成柱效下降的原因有很多，但最基本的原因是使用不當(dāng)，造成填料特性或柱床結(jié)構(gòu)的改變所致。

          （1）pH值  流動相的pH值是柱子使用中最需要注意的參數(shù)。以硅膠為基質(zhì)的色譜填料通常僅適于在pH值2~8的范圍內(nèi)使用。過低過高的pH值都會造成填料配基脫落或基質(zhì)的溶解。有時，僅僅是樣品溶液的pH值影響，也會使柱子性能極大地破壞。

          （2）非特異性吸附 樣品中強極性或具有強非特異性吸附的物質(zhì)有可能吸附于填料表面，形成非特異性吸附層，改變柱子的表面活性，使分離性能發(fā)生變化，并使柱效降低。例如，有些植物色素經(jīng)常會吸附于柱頭，使柱子進(jìn)口端顏色加深，整體柱效下降；有些蛋白質(zhì)成分會在柱頭變性而沉淀下來。

          （3）填料流失     制造不當(dāng)?shù)牧淤|(zhì)濾板，以及上述的壓力脈沖等

          （4）柱外效應(yīng)   過長的連接管線、連接管線內(nèi)徑太大、過大的檢測池體積、過大的進(jìn)樣體積等等，均會造成柱效下降。

          3.  峰形異常

           色譜的譜圖是進(jìn)行色譜分離分析時的基本結(jié)果和數(shù)據(jù)。在優(yōu)化的條件下，色譜峰應(yīng)是左右對稱的高斯峰，彼此分離良好，且數(shù)據(jù)具有重復(fù)性。

          （1）分裂峰   分裂峰是峰頂端“分叉”，成為兩個峰尖。出現(xiàn)這種情況時，往往所有的峰都發(fā)生分裂，而不是單獨某一個峰分裂。分裂峰多是因為入口濾片上堵塞的固體雜質(zhì)導(dǎo)致樣品溶液流型改變而引起的。此外，柱入口端柱床塌陷和進(jìn)樣時進(jìn)樣閥切換動作不連續(xù)也會造成譜帶流型分裂而形成分裂峰。

          （2）拖尾峰 拖尾峰多是由于硅膠表面殘留的硅醇基和硅膠基質(zhì)中的金屬離子雜質(zhì)對極性溶質(zhì)的非特異性吸附而造成的。在使用過程中，pH值不當(dāng)引起的配基脫落，非特異性吸附造成填料表面活性位點的損失及“新”活性位點的產(chǎn)生等填料表面性質(zhì)的改變，均會形成拖尾峰。此外，過大的進(jìn)樣量會造成非線性吸附，性能已經(jīng)改變的柱子導(dǎo)致相鄰峰的不完全分離也會形成類似拖尾的峰。

          （3）無規(guī)雜峰    流動相中高保留雜質(zhì)在填料上的累積和慢洗脫，流動相長霉產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，管路和進(jìn)樣閥等部件表面吸附的雜質(zhì)的釋放，前幾次進(jìn)樣后沒有洗脫的強保留峰在以后的進(jìn)樣時出的峰，以及樣品分解與變質(zhì)產(chǎn)生的物質(zhì)等（如蛋白質(zhì)樣品降解為肽等），均可產(chǎn)生無規(guī)雜峰。另外，在進(jìn)行梯度洗脫時溶劑和流動相中雜質(zhì)濃集效應(yīng)（低淋洗強度時吸附，高淋洗強度時洗脫出來）也屬此類。

          （4）基線不穩(wěn)  強保留雜質(zhì)的慢解吸基線不斷提高。 有時檢測器和電路系統(tǒng)的不穩(wěn)定也會引起基線的不穩(wěn)。

          （5）倒峰   當(dāng)柱子中有吸光度比流動相低的溶劑或低（無）光吸光性物質(zhì)流出是，因光吸收值低于流動相，會表現(xiàn)為倒峰。

          4.  “烷基配基坍塌”現(xiàn)象

           在使用高比例水為流動相時，有時會出現(xiàn)所謂“烷基配基坍塌”的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，主要是由于隨著流動相中水比例的增高，流動相與硅膠的接觸角迅速增大，導(dǎo)致流動相難以進(jìn)入填料硅膠的細(xì)小孔中，也不能浸潤孔內(nèi)表面所致。這樣必然會造成溶質(zhì)在兩項中分布情況的改變，產(chǎn)生保留時間減少、柱效降低、峰形變壞以及峰的拖尾等問題。

杭州森尼歐提供液相色譜儀色譜柱的選擇指南

　　現(xiàn)代液相色譜儀色譜中，分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇。但是色譜填料的選擇范圍很寬，要做合適的選擇，必須對此有一定的認(rèn)識和了解。
一、硅膠基質(zhì)填料：
1、正相色譜
　　正相色譜用的固定相通常為硅膠（Silica）以及其它具有極性官能團,如胺基團（NH2,APS）和氰基團（CN,CPS）的鍵合相填料。
　　由于硅膠表面的硅羥基（SiOH）或其它極性基團極性較強，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中各組份的極性大小，即極性較弱的組份zui先被沖洗出色譜柱。
　　正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如：正己烷（Hexane）、氯仿（Chloroform）、二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
2、反相色譜
　　反相色譜用的填料常是以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有極性相對較弱的官能團的鍵合相。反相色譜所使用的流動相極性較強，通常為水、緩沖液與甲醇、乙腈等的混合物。
　　樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組份zui先被沖洗出，而極性弱的組份會在色譜柱上有更強的保留。
　　常用的反相填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
二、聚合物填料
　　 聚合物填料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯等，其主要優(yōu)點是在pH值為1～14均可使用。
　　相對于硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有更強的疏水性；大孔的聚合物填料對蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。
　　現(xiàn)有的聚合物填料的缺點是相對硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。
三、其它無機填料
　　其它HPLC的無機填料色譜柱也已經(jīng)商品化。由于其特殊的性質(zhì)，一般于特殊的用途。如，石墨化碳正逐漸成為反相色譜柱填料。這種填料的分離不同于硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性。該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強。石墨化碳可用于分離某些幾何異構(gòu)體,又由于在HPLC流動相中不會被溶解, 這類柱可在任何pH與溫度下使用。 氧化鋁也可用于HPLC,氧化鋁微粒剛性強，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點是可在pH高達(dá)12的流動相中使用。但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強，應(yīng)用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應(yīng)用。新型氧化鋯基質(zhì)色譜填料也可用于HPLC,商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用pH范圍1～14，溫度可達(dá)100℃。由于氧化鋯填料是zui近幾年才開始研究，加之面臨的實驗難度，其重要用途與優(yōu)勢尚在進(jìn)行中。
　　當(dāng)然和氣相色譜的原理一樣，液相色譜的柱長度，柱內(nèi)徑對分離效果也有重要的影響。
　　您現(xiàn)在就可以看到其實液相色譜柱的分離效果主要取決于其色譜填料，柱長度，柱內(nèi)徑這幾個因素，從原理上講，這幾個因素相同的柱子，其分離效果是完全一樣的。
　　考慮到這一點，現(xiàn)在您完全根據(jù)這個更加本質(zhì)的依據(jù)來現(xiàn)在您的液相色譜柱，而不必一定去現(xiàn)在昂貴的標(biāo)準(zhǔn)指定液相色譜柱。