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色譜柱填料粒度的選擇 色譜柱如何操作

時間：2020-08-31    來源：儀多多儀器網(wǎng)    作者：儀多多商城     
      目前，商品化的色譜填料粒度從1μm到超過30μm均有售，而目前分析分離主要用3、5和10μm填料。填料的粒度主要影響填充柱的兩個參數(shù)，即柱效和背壓。粒度越小，填充柱的柱效越高；然而粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限制了粒度小于3μm的填料應(yīng)用。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯一的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小粒度的填料是很有用的。3μm填料填充柱的柱效比相同條件下的5μm填料的柱效提高近30%；然而，3μm的色譜柱的背壓卻是5μm的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱，以縮短分析時間。另外，可以采用低粘度的溶劑做流動相或增加色譜柱的使用溫度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色譜柱的壓力。
  色譜柱使用前的注意事項　　色譜柱在使用前，應(yīng)進(jìn)行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。　　但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的(出廠測試所使用的條件是較佳條件)，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。　　樣品的前處理　　a、使用流動相溶解樣品。　　b、使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。　　c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。　　流動相的配制　　液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：　　a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。條件進(jìn)行　　b、流動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。　　c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。　　d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，應(yīng)使用對紫外吸收較低的溶劑配制。　　e、流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進(jìn)行。　　f、在流動相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。　　流動相流速的選擇　　因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求較佳柱效，較好使用較佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。　　當(dāng)選用較佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間(如使用反相柱時，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。　　注意：　　1．由于甲醇廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。　　2．對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動相，沒有提純的己烷不得使用。用水較好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。　　3．含水流動相在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。應(yīng)加入氮化鈉，防止細(xì)菌生長。　　4．流動相要求使用0.45μm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。　　5．使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
 　　如何緩解賽默飛色譜柱頻繁損壞的問題　　賽默飛色譜柱具有數(shù)字通訊功能，軟件與儀器的聯(lián)控功能，直接鼠標(biāo)點擊，就可以完成各種檢測。檢測器傳輸采用三級齒輪減速結(jié)構(gòu)，儀器抗震性能優(yōu)越，防止運輸及使用過程震動；采用高亮度OLED顯示屏，優(yōu)越的美觀可視效果，超高的質(zhì)量穩(wěn)定性。內(nèi)置氘燈和氘燈，內(nèi)置器件無需更換即可實現(xiàn)波長從190-850nm轉(zhuǎn)換；儀器使用原裝氘燈，可手動關(guān)/開，更換氘燈時，不必調(diào)整光軸，維護簡便，氘燈使用壽命長。光路系統(tǒng)采用優(yōu)先的凹面光柵器件、結(jié)合精密定位結(jié)構(gòu)和獨特的散熱技術(shù)，使波長精度高，偏移小和穩(wěn)定時間短，的光學(xué)系統(tǒng)和數(shù)字過濾極大的提高了儀器的靈敏度和結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性并保證了儀器的穩(wěn)定可靠。人性化、便攜化的軟件界面，人機工程的操作平臺與按鍵，操作便捷、快速；樣品和參比能量顯示便于故障的判斷和排查；儀器內(nèi)部安全報警與自動故障排查功能，維護方面快捷。具有波長自動校正功能，自動調(diào)零，多量程輸出選擇可滿足各濃度分析需求。　　在賽默飛色譜柱的使用中，我們會發(fā)現(xiàn)很多實驗室會面臨色譜柱頻繁損壞的問題。需要來了解一下色譜柱的損壞來源于哪些方面：　　泵頭密封圈的磨損；進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)子密封圈的磨損；析出的緩沖鹽；樣品中的復(fù)雜易吸附基質(zhì)等等；其實，在工作過程中大多數(shù)的顆粒物堵塞導(dǎo)致的色譜柱背壓升高問題是體現(xiàn)在柱頭堵塞。而樣品的易吸附機制也可能會和柱前端的硅膠表面游離的硅醇基發(fā)生作用導(dǎo)致色譜柱背壓升高。但是這種情況在較低的PH系統(tǒng)中會有所改善，因為較低的PH系統(tǒng)會降低硅膠表面的硅醇基發(fā)生解離。　　預(yù)防措施：　　1、在液相系統(tǒng)中加入在線過濾器　　在線過濾器的內(nèi)部顆?？障兑话闶?.5微米，對于UHPLC會選擇0.2微米空隙的在線過濾器。這個空隙尺寸和柱頭的過濾篩板尺寸接近或者略小。所以，在線過濾器能夠有效的阻隔來自樣品、泵頭密封墊、自動進(jìn)樣器的轉(zhuǎn)子密封墊的顆粒物，以防止柱頭過濾篩板的堵塞。注意：但是對于非常低死體積的液相系統(tǒng)，在線過濾器的加入可能會導(dǎo)致系統(tǒng)死體積增大峰展寬變嚴(yán)重的問題。而對于大多數(shù)的液相系統(tǒng)而言，色譜圖不會有太大變化。　　2、在柱子前端使用保護柱　　保護柱有很多種，通用型、一體式、卡套式，但是它其實是一個和分析柱固定相相同的10-20mm的小柱子。因為它具有和分析柱相同的內(nèi)部填料，所以保護柱不僅可以阻隔顆粒物，還可以阻隔易吸附的樣品基質(zhì)組分。注意：由于保護柱中可能有大量的強保留組分，在用強溶劑清洗系統(tǒng)時請取下保護柱，以防止這些強保留組分被洗脫進(jìn)分析柱。保護柱如果出現(xiàn)吸附飽和也可能會對分離效果有影響。　　3、對樣品進(jìn)行凈化處理　　有一些液相的分析方法沒有明確標(biāo)注樣品的凈化，但我希望大家在做分析時都能夠考慮樣品的凈化，常用的方案是對樣品進(jìn)行過濾。在實際工作中，賽默飛色譜柱的儲存也會影響柱子的使用壽命。那么對于色譜柱的儲存，也有以下建議：　　4、使用時注意事項：　　.為避免管路中的有機溶劑和氣泡進(jìn)入色譜柱，先用水沖洗整個色譜系統(tǒng)，然后才能接入凝膠柱。　　.不要讓有機溶劑進(jìn)入柱中，否則會使填料脫水，導(dǎo)致柱床損壞，要小流速開啟泵，不要快速加大流速，以防止壓力迅猛升高而導(dǎo)致柱床損壞。15mm的柱子流速不要超過3ml/min。　　.每次使用后務(wù)必用蒸餾水沖洗干凈將含鹽的流動相置換干凈，若較長時間不用請按保存方法保存。　　5、保存方法：　　.將凝膠柱用蒸餾水沖凈后充上0.02%-0.05%的疊氮鈉水溶液封存，或三氯丁醇苯基汞代鹽將色譜柱封閉后低溫保存(溫度在5℃左右)在冰箱。　　.再次使用時，用蒸餾水將保護溶液沖洗掉即可使用。　　.如果次日還要使用也要從系統(tǒng)中取下，將賽默飛色譜柱封閉后存于4~8度的冰箱中冷藏。

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