高效液相色譜儀測(cè)定氨基酸的含量
1  L--色氨酸含量的測(cè)定
1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
色氨酸樣品，甲醇， STI501液相色譜儀梯度系統(tǒng)，UV501紫外檢測(cè)器，7725I手動(dòng)進(jìn)樣閥，N2000色譜工作站，0.03%KH2PO4溶液
1.2 HPLC色譜分析條件
流動(dòng)相為0.03%KH2PO4溶液（A）-甲醇（B），線(xiàn)性梯度淋洗，流速1.0mL/min，柱溫 35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)276nm。
流動(dòng)相 時(shí)間（t/min）
 5 10 15 20
A（%） 80 90 80 70
B（%） 20 10 20 30
1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
精密稱(chēng)取色氨酸標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品50mg，置100ml容量瓶中，振搖，用流動(dòng)相溶解到刻度，作為供試品溶液，另取色氨酸樣品適量，同法操作。
1.4 標(biāo)準(zhǔn)直線(xiàn)的制作
精密稱(chēng)取色氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品適量 ,分別稀釋制成每1ml 中含色氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液，注入液相色譜儀，以色氨酸峰面積A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，制作回歸標(biāo)準(zhǔn)直線(xiàn)。
1.5 發(fā)酵液中樣品中色氨酸含量的測(cè)定
取發(fā)酵液，稀釋配制成約 500μg/ ml 的溶液，搖勻，過(guò)濾，取25μl進(jìn)樣，在高效液相色譜儀下測(cè)量，記錄峰值面積，作圖。
2 L-精氨酸含量的測(cè)定
2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，乙腈， STI501液相色譜儀梯度系統(tǒng)，UV501紫外檢測(cè)器，7725I手動(dòng)進(jìn)樣閥，N2000色譜工作站，磷酸二氫銨。
PH計(jì)，磷酸，
2.2 　HPLC色譜分析條件
流動(dòng)相: 以磷酸二氫銨溶液 ( 稱(chēng)取磷酸二氫銨1.15g, 加水800m溶解后, 用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.0±0.1, 加水稀釋至 1000ml ) - 乙腈為流動(dòng)相，線(xiàn)性梯度淋洗; 柱溫為30℃檢測(cè)波長(zhǎng)為206nm；進(jìn)樣量：25μl。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)直線(xiàn)的制作
精密稱(chēng)取精氨酸標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品50mg，置100ml 容量瓶中，振搖，用流動(dòng)相溶解到刻度，作為供試品溶液，另取色氨酸樣品適量，同法操作。精密稱(chēng)取精氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品適量 ,分別稀釋制成每1ml 中含精氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg 的溶液，注入液相色譜儀，以精氨酸峰面積A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，制作回歸標(biāo)準(zhǔn)直線(xiàn)。
2.4 發(fā)酵液中樣品中精氨酸含量的測(cè)定
取發(fā)酵液，稀釋配制成約 500μg/ ml 的溶液，搖勻，過(guò)濾，取25μl 進(jìn)樣，在高效液相色譜儀下測(cè)量，記錄峰值面積，作圖。

3 L-甘氨酸含量的測(cè)定
3.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑
    乙酸銨溶液；乙腈；L-甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品； STI501液相色譜儀梯度系統(tǒng)，UV501紫外檢測(cè)器，7725I手動(dòng)進(jìn)樣閥，N2000色譜工作站。
3.2 ＨＰＬＣ色譜分析條件
流動(dòng)相:A為0.02%mol/L乙酸銨溶液（PH=6.5）:B為乙腈，線(xiàn)性梯度淋洗；流速: 110 mL/min ；柱溫:30℃；進(jìn)樣量:２0μL。
梯度洗脫表3
流動(dòng)相 時(shí)間（t/min）
 10 20 30 40 50 60
A（%） 80 60 40 40 60 80
B（%） 20 40 60 60 40 20
3.3 標(biāo)準(zhǔn)直線(xiàn)的制作
方法同2.2節(jié)
3.4 發(fā)酵液中樣品中甘氨酸含量的測(cè)定
     方法同2.5節(jié)

4 L-甲硫氨酸含量的測(cè)定
4.1   實(shí)驗(yàn)儀器和試劑
   L-甲硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品；甲醇；醋酸鈉； STI501液相色譜儀梯度系統(tǒng)，UV501紫外檢測(cè)器，7725I手動(dòng)進(jìn)樣閥，N2000色譜工作站。
4.2   HPLC色譜分析條件
流動(dòng)相: A為甲醇 , B為 50 mmol /L的醋酸鈉緩沖溶液;流速1 . 0 mL /min;梯度洗脫見(jiàn)表1，測(cè)定波長(zhǎng)為 262 nm，柱溫為30℃。
梯度洗脫表4
流動(dòng)相                 時(shí)間（t/min）
 10 20 30 40 50 60
A（%） 30 50 80 85 100 100
B（%） 70 50 20 15 0 0
4.3   標(biāo)準(zhǔn)直線(xiàn)的制作
方法同2.2節(jié)
4.4   發(fā)酵液中樣品中甲硫氨酸含量的測(cè)定
     方法同2.5節(jié)
5 回收率實(shí)驗(yàn)
　 稱(chēng)取甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)液50μg/ml分別稀釋0、1、2、4、6、8、10倍，每份取1ml，按標(biāo)準(zhǔn)樣品處理方法，過(guò)濾，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品中的甘氨酸的含量，計(jì)算回收率。

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　　液相色譜儀根據(jù)固定相是液體或是固體，又分為液-液色譜(LLC）及液-固色譜(LSC）?，F(xiàn)代液相色譜儀由高壓輸液泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、色譜柱、檢測(cè)器、信號(hào)記錄系統(tǒng)等部分組成。與經(jīng)典液相柱色譜裝置比較，具有、快速、靈敏等特點(diǎn)。　　
　　液相色譜儀19個(gè)常見(jiàn)故障的排除方法：
　　
　　1.操作過(guò)程若發(fā)現(xiàn)壓力很小，則可能管件連接有漏，注意檢查。當(dāng)出現(xiàn)錯(cuò)誤警告(各組件指示燈均為紅色)，一般為漏液，其中一個(gè)感應(yīng)器中已有溶劑，漏液故障排除后，擦干，點(diǎn)擊Online操作界面中的Instrument/SystemOff，然后再點(diǎn)擊操作界面中的Instrument/SystemOn即可；
　　
　　2.連接柱子與管線(xiàn)時(shí)，應(yīng)注意擰緊螺絲的力度，過(guò)度用力可導(dǎo)致連接螺絲斷裂。柱接頭處易發(fā)生漏液，可能情況為接頭Fittings中間的管子未和接口處貼緊。不同廠(chǎng)家的管線(xiàn)及色譜柱頭結(jié)構(gòu)有差異，不要混用，必要時(shí)可使用PEEK管及活動(dòng)接頭；
　　
　　3.操作過(guò)程若發(fā)現(xiàn)壓力非常高，則可能管路已堵，應(yīng)先卸下色譜柱，然后用分段排除法檢查，確定何處堵塞后解決。若是保護(hù)柱或色譜柱堵塞，可用小流量流動(dòng)相或以小流量異丙醇沖洗，還可采用小流量反沖的辦法(新柱不提倡)，若還是無(wú)法通暢，則需換柱；
　　
　　4.運(yùn)行過(guò)程中自動(dòng)停泵，可能為壓力超過(guò)上限或流動(dòng)相用完；
　　
　　5.樣品瓶中樣品較少，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣針無(wú)法到達(dá)液面，可采用調(diào)低進(jìn)樣針進(jìn)樣高度的辦法，注意設(shè)置時(shí)不要使進(jìn)樣針碰到瓶底，微量樣品分析應(yīng)使用微量樣品瓶；
　　
　　6.自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣針未與樣品瓶瓶口對(duì)準(zhǔn)時(shí)，需重新定位；
　　
　　7.泵壓不穩(wěn)或流量不準(zhǔn)，可能為柱塞桿密封圈問(wèn)題或sealwash墊圈問(wèn)題，需更換；
　　
　　8.基線(xiàn)產(chǎn)生不規(guī)則噪聲，可能原因?yàn)橄到y(tǒng)不穩(wěn)定或沒(méi)達(dá)到化學(xué)平衡(使其平衡，若用離子對(duì)試劑，在使用使需要足夠的時(shí)間和溶劑體積，色譜柱才能達(dá)到足夠的平衡)，流動(dòng)相被污染(更換流動(dòng)相，清洗儲(chǔ)液器、過(guò)濾器，沖洗并重新平衡系統(tǒng))，色譜柱被污染(為證明可能的原因更換系統(tǒng)的色譜柱或使用一根同類(lèi)的被證明性能好的色譜柱)，檢測(cè)器不穩(wěn)定；
　　
　　9.短期有規(guī)則的噪聲，可能原因?yàn)楸脡翰环€(wěn)或泵脈沖，調(diào)節(jié)溶劑不適當(dāng)(如，兩種溶劑的互溶性問(wèn)題)，泵入口管路松或堵塞，泵太臟，泵柱塞磨損，檢測(cè)器不穩(wěn)定；
　　
　　10.長(zhǎng)期有規(guī)則噪聲，可能原因?yàn)槭覝夭环€(wěn)(未使用柱溫箱)或使用柱溫箱不當(dāng)；
　　
　　11.基線(xiàn)漂移，可能原因?yàn)橄到y(tǒng)不穩(wěn)或沒(méi)有達(dá)到化學(xué)平衡，室溫不穩(wěn)(未使用柱溫箱)，流動(dòng)相污染或分解，柱污染，檢測(cè)池泄漏，系統(tǒng)泄漏，固定相流失(另選流動(dòng)相，另選色譜柱)，測(cè)定的波長(zhǎng)選擇錯(cuò)誤(對(duì)溶劑有吸收)，樣品組分保留太長(zhǎng)(用強(qiáng)度合適的溶劑清洗色譜柱)，檢測(cè)器不穩(wěn)定；
　　
　　12.每次進(jìn)樣時(shí)的保留時(shí)間不重復(fù)，可能原因?yàn)橄到y(tǒng)不穩(wěn)或未達(dá)到化學(xué)平衡，由于氣泡、各部件磨損等原因引起的泵壓或泵脈沖輸液不穩(wěn)定，進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高平衡被破壞，溶劑配比不合適，柱被污染；
　　
　　13.無(wú)峰，可能原因?yàn)闄z測(cè)器選擇錯(cuò)誤，使用錯(cuò)誤的流動(dòng)相，樣品降解；
　　
　　14.色譜峰比預(yù)計(jì)的小，可能原因?yàn)檫M(jìn)樣體積錯(cuò)誤，檢測(cè)器燈故障，進(jìn)樣問(wèn)題(瓶號(hào)錯(cuò)、進(jìn)樣體積不合適、進(jìn)樣錯(cuò)誤、針頭堵塞)；
　　
　　15.峰變寬，可能原因?yàn)檫M(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高，過(guò)濾器、保護(hù)柱入口、柱入口或連接管路有部分堵塞，檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤，進(jìn)樣器問(wèn)題(如，閥漏、針頭堵塞或損壞)，柱或保護(hù)柱被污染，對(duì)流動(dòng)相來(lái)說(shuō)樣品溶劑太強(qiáng)，使用錯(cuò)誤的色譜柱，溫度變化;
　　
　　16.出現(xiàn)雙峰/肩峰，可能原因?yàn)楸Ｗo(hù)柱或柱入口部分阻塞，柱或保護(hù)柱被污染，柱性能下降，保護(hù)柱失效，進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高(樣品過(guò)載)，平衡破壞;
　　
　　17.前沿峰，可能原因?yàn)檫M(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高(樣品過(guò)載)，平衡破壞，對(duì)于流動(dòng)相來(lái)說(shuō)樣品溶劑非極性太強(qiáng)(對(duì)于反相柱)，柱或保護(hù)柱被污染，柱性能下降，保護(hù)柱失效;
　　
　　18.脫尾峰，可能原因?yàn)橹虮Ｗo(hù)柱被污染，柱性能下降，保護(hù)柱失效，進(jìn)樣器問(wèn)題(如，閥漏等)，檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤;
　　
　　19.出現(xiàn)鬼峰，可能原因?yàn)榱鲃?dòng)相被污染，樣品預(yù)處理時(shí)產(chǎn)生降解或混入雜質(zhì)，先前進(jìn)樣的流出物，樣品定量管清洗不當(dāng)，注射器臟，柱被污染，進(jìn)樣裝置被污染，流動(dòng)相中含有穩(wěn)定劑/穩(wěn)定劑變化。水膜和油膜的外殼有標(biāo)示的。

    液相色譜儀的日常操作條件：溫度：10-40℃；相對(duì)濕度<80％；可以是恒溫、恒濕，遠(yuǎn)離高電干擾、高振動(dòng)設(shè)備，使用后液相色譜儀檢測(cè)器的保養(yǎng)對(duì)液相色譜儀的使用壽命影響至關(guān)重要。

    微小的顆粒雜質(zhì)或薄膜沉積在流通池里，會(huì)導(dǎo)致基線(xiàn)噪聲的增加或降低靈敏度。此時(shí)必須進(jìn)行清洗處理。一般常規(guī)清洗不必拆下流通池，可直接在流通池入口處（即檢測(cè)器輸入端），接上一個(gè)專(zhuān)用的注射器接頭，依次用去離子水、酒精和3MHNO3沖洗流通池，最后用去離子水反復(fù)沖洗數(shù)次。檢測(cè)器出口用玻璃瓶盛接流出的廢液。

    若檢測(cè)器已長(zhǎng)期使用或受到高濃度樣品的污染，經(jīng)上述方法還不能除去污垢，就得取下流通池，液相色譜儀檢測(cè)器的保養(yǎng)按以下步驟拆開(kāi)進(jìn)行清洗：

    1)卸下紫外檢測(cè)器側(cè)面遮蓋流通池的蓋板，松開(kāi)固定流通池支架的螺釘，小心地取出流通池支架。

    2)拆下連接流通池輸入、輸出端的不銹鋼導(dǎo)管（或PEEK導(dǎo)管），卸下流通池體。仔細(xì)擰下石英窗和透鏡的護(hù)圈。小心取下墊圈、石英窗、透鏡、護(hù)圈，放在一個(gè)盛有乙醇的燒杯內(nèi)，用超聲波清洗機(jī)處理5min~10min。

    3)用蒸餾水、乙醇沖洗流通池，并用超聲波清洗，最后用去離子水沖洗數(shù)次，除去池內(nèi)雜物。

    4）烘干各部件（注意：避免用手直接接觸透鏡及石英窗）。

    5）重新裝配流通池體。

    6)按原樣裝在流通池支架上，并接好導(dǎo)管，并進(jìn)行試漏。（方法：池體輸入端與恒流泵連接，開(kāi)啟恒流泵（流動(dòng)相用蒸餾水），視各密封點(diǎn)及石英窗口是否有漏液溢出。

    7）裝入紫外檢測(cè)器機(jī)箱內(nèi)，蓋上蓋板，并用原螺釘、螺帽固定。

    注：上述液相色譜儀檢測(cè)器的保養(yǎng)拆洗應(yīng)有經(jīng)培訓(xùn)過(guò)的專(zhuān)業(yè)維修人員進(jìn)行。

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