一、測定波長目前國內(nèi)常見的ELISA試劑盒所使用的標記用酶均為辣根過氧化物酶(HRP)，底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)，其在過氧化氫溶液的存在下，經(jīng)HRP作用，分別氧化為2,2,-二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌。當pH值為5.0左右時，DAB在450nm波長處有最大吸收，當pH值降為L0時，最大吸收波長移至492nm,同時摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深，因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長450nm處有最大消光系數(shù)，如果HRP量少，H:O:和TMB過量時，則形成藍色的陽離子根。降低pH,即可使藍色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min.因此，450nm和492nm兩個波長是目前ELISA測定常用的。各種酶標儀都配有放置濾光片的可自動轉(zhuǎn)換的部件，可以同時安裝6~8片濾光片，所配備的濾光片均應包括上述兩個波長，有的酶標儀以490nm濾光片替代492nm濾光片，影響不大一般酶標儀的測定波長在400~750nm或800nm之間，完全可以滿足ELISA的顯色測定。。除了這兩個基本濾光片外，考慮到雙波長比色的需要，還應有620nm或630nm或650nm和405nm波長的濾光片，其他濾光片可根據(jù)自己的需要選擇。有時，有的實驗室希望用酶標儀作微量生化測定，故酶標儀生產(chǎn)廠家對其生產(chǎn)的酶標儀擴展了紫外檢測功能，此時需要一個340nm波長濾光片。此時，酶標儀的測定波長范圍就成為340-750nm或800nm。酶標儀有單波長和雙波長檢測功能有時使用者不知在什么情況下使用單或雙波長檢測。所謂的“單波長”就是使用一種對顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進行比色測定；而“雙波長”則除了用對顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進行比色測定外，同時用對特異顯色不敏感的波長如630nm進行測定，酶標儀最后打印出來的吸光度則為二者之差。630nm波長下得到的吸光度是非特異的，來自于板子上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此，在ELISA比色測定中，可以使用雙波長，且不必設空白孔。

　　二、測定的吸光度范圍通常，酶標儀的吸光度測定范圍在。0-2.5之間即可以滿足ELISA的測定要求。早期的酶標儀可測定的吸光度一般在0-2.5之間，但現(xiàn)在基本上都做了拓寬，可達到3.5以上，并且能保持很好的精密度與線性。如Labsystems公司DragonWellscanMK-2的吸光度測定范圍為0-3.5，而MultiskanAscent的吸光度測定范圍(Abs)達0-4.0，在0-4.0范圍，線性誤差不超過±2.0%，在0.3-3.0吸光度范圍內(nèi)，測定精密度CV小于±0.2%；3.0-4.0Abs范圍內(nèi)，測定精密度CV小于士0.2%。因此，對于酶標儀的吸光度范圍不必去刻意追求大的吸光度范圍，主要要看在一定的吸光度范圍內(nèi)的線性和精密度如何。

　　三、光學系統(tǒng)酶標儀的光學系統(tǒng)采用的是垂直光路多通道(通常為8或12通道，亦有單通道)檢測，一般為硅光管或光導纖維，除測定通道外，有的酶標儀還有一個參比通道，每次測定可進行自我校準。酶標儀的光學系統(tǒng)功能如何，均可通過酶標儀測定的吸光度范圍、線性度、精密度和準確度等體現(xiàn)出來。光學系統(tǒng)好的話，則上述指標也應較佳。測定的精密度與測定通道之間的均一性有直接關(guān)系。單通道可避免因通道不同所致的差異。