液相色譜儀根據(jù)固定相是液體或是固體，又分為液-液色譜(LLC）及液-固色譜(LSC）?，F(xiàn)代液相色譜儀由高壓輸液泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、色譜柱、檢測(cè)器、信號(hào)記錄系統(tǒng)等部分組成。與經(jīng)典液相柱色譜裝置比較，具有高效、快速、靈敏等特點(diǎn)。

　　液相色譜儀操作步驟：

　　1. 首先對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾，根據(jù)需要選擇不同的濾膜，一般為有機(jī)系和水系，常用的孔徑為0.20um和0.45um。

　　2. 對(duì)抽濾后的流動(dòng)相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。

　　3. 正常情況下，儀器首先用甲醇沖洗10-20分鐘，然后再進(jìn)入測(cè)試用流動(dòng)相(如流動(dòng)相為緩沖試劑，則要二次重蒸水沖洗10-20分鐘，直至色譜柱中有機(jī)相沖凈為止) 。

　　4. 一般情況下，流動(dòng)相沖洗20-30分鐘后，儀器方可穩(wěn)定，較為重要的是儀器基線走后，方可進(jìn)樣測(cè)試。

　　5. 同時(shí)進(jìn)兩針標(biāo)樣，將其結(jié)果相比較，其結(jié)果的比值在0.98-1.02之間后，就可以正式進(jìn)行樣品的測(cè)試了。

　　6. 樣品測(cè)試結(jié)束后，就要進(jìn)行色譜儀及色譜柱的清洗和維護(hù)。如流動(dòng)相為緩沖試劑，同樣也要用重蒸水清洗10-20分鐘，方可用有機(jī)相進(jìn)行保護(hù)，否則，有損色譜柱。

　　7). 關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)計(jì)算機(jī)，再關(guān)液相色譜。

　　液相色譜注意事項(xiàng)：

　　1. 流動(dòng)相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣后的流動(dòng)相要小心振動(dòng)盡量不引起氣泡。

　　2. 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過(guò)柱子。

　　3. 所有過(guò)柱子的液體均需嚴(yán)格的過(guò)濾。

　　4. 壓力不能太大，可以不要超過(guò)150kgf/cm2 .

　　5. 因?yàn)榫彌_試劑遇有機(jī)溶劑，會(huì)結(jié)晶，有損色譜柱，所以，每次由有機(jī)相變流動(dòng)相或流動(dòng)相變有機(jī)相均需用蒸餾水清洗。

液相色譜用溶劑分為流動(dòng)相用溶劑和空白溶劑。選擇的溶劑一般應(yīng)具有低粘度、高純度、化學(xué)穩(wěn)定性好對(duì)樣品有合適的極性和良好的選擇性、與檢測(cè)器兼容性強(qiáng)、低毒等特征。

流動(dòng)相溶劑的選擇沒有一定的模式，更多的來(lái)源于經(jīng)驗(yàn)的積累，但溶劑的極性和理化性質(zhì)可以作為重要的選擇依據(jù)。流動(dòng)相所用溶劑一般為二元或多元溶劑，以便于靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性和增加選擇性，以改進(jìn)分離和調(diào)整出峰時(shí)間。選擇溶解樣品的空白溶劑時(shí)一般要綜合考慮到樣品的極性和溶解度、溶劑的洗脫強(qiáng)度和組成、進(jìn)樣量等因素進(jìn)而選擇合適的溶劑，為了選擇的簡(jiǎn)便性的同時(shí)避免溶劑效應(yīng)的產(chǎn)生，一般選擇同流動(dòng)相所選溶劑一致或相似。

低粘度

粘度過(guò)高會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散增大柱壓、降低柱效，延長(zhǎng)分離時(shí)間，不利于色譜峰的分離。但粘度過(guò)于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、yi醚等，它們易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響泵的工作，不利于色譜柱的分離效果。同時(shí)色譜峰的塔板數(shù)與流動(dòng)相溶劑的粘度成反比，粘度越大理論塔板數(shù)越低。而粘度與沸點(diǎn)密切相關(guān)，通常選用沸點(diǎn)高于柱溫20～50℃但低于100℃，粘度不大于5×10^-4Pa.S的溶劑作為液相色譜用溶劑。

高純度

由于液相靈敏度高，對(duì)溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，即可使截止波長(zhǎng)值大幅增加。同時(shí)色譜柱的壽命與溶劑純度也有關(guān)，當(dāng)含有大量雜質(zhì)的溶劑流過(guò)色譜柱，雜質(zhì)富集在色譜上極易造成色譜柱的堵塞。液相所用溶劑應(yīng)盡量達(dá)到HPLC級(jí)，理論上完全由HPLC級(jí)溶劑組成的流動(dòng)相不需要過(guò)濾，但考慮到溶劑中溶解有氣體，在洗脫過(guò)程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低產(chǎn)生氣泡，若富集于檢測(cè)池中會(huì)增大基線噪音，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成分析靈敏度下降。溶劑中溶解的氧氣也會(huì)導(dǎo)致某些組分或色譜柱的固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。同時(shí)溶劑在存儲(chǔ)分裝過(guò)程中會(huì)引入部分雜質(zhì)，建議即使是HPLC級(jí)的溶劑亦需要進(jìn)行過(guò)濾處理。

具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，對(duì)樣品有合適的極性和良好的選擇性

溶劑不能與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合，一般的選擇原則為相似相容原則即極性大的試樣用極性強(qiáng)的洗脫劑，極性弱的試樣用極性弱的洗脫劑。所選溶劑亦不得改變色譜柱填料的任何性質(zhì)。如低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料遇到部分有機(jī)溶劑會(huì)溶脹或收縮，改變色譜柱的性質(zhì)。正相色譜分配中流動(dòng)相的極性小于固定相的極性以利于極性化合物的分離；反向分配色譜中流動(dòng)相的極性大于固定相的極性以利于非極性化合物的分離。對(duì)樣品的溶解度要適宜，如果溶解度欠佳，樣品可能會(huì)在柱頭析出富集，不但會(huì)影響色譜峰的分離，也會(huì)損壞色譜柱，堵塞儀器管路。在一般的色譜分析中我們用到的溶劑多為二元溶劑或多元溶劑，溶劑的極性是通過(guò)混合溶劑的比例進(jìn)行調(diào)節(jié)的，改變?nèi)軇┑臉O性，增加溶劑的選擇性，進(jìn)而改善分離和出峰時(shí)間。當(dāng)樣品用非流動(dòng)相溶解時(shí)，如果樣品的洗脫強(qiáng)度比流動(dòng)相弱，可適當(dāng)加大進(jìn)樣體積，一般對(duì)峰寬和分離度無(wú)不良影響。但有時(shí)為了完成樣品的溶解性，會(huì)用強(qiáng)洗脫能力的溶劑溶解樣品，樣品溶劑可看為流動(dòng)相的一部分，溶解在其中的樣品在其帶動(dòng)下在色譜柱快速遷移，而部分樣品同時(shí)會(huì)溶解在流動(dòng)相中，產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，使峰變寬分叉，部分析出的樣品會(huì)堵塞色譜柱和儀器管路，造成分析方法準(zhǔn)確度下降。在選用強(qiáng)洗脫能力的溶劑溶解樣品時(shí)要適當(dāng)降低進(jìn)樣量，以避免溶劑效應(yīng)的產(chǎn)生。我們選擇樣品溶劑的一般原則為實(shí)驗(yàn)要求的流動(dòng)相，如流動(dòng)相中含有大量的鹽，一般會(huì)選擇有機(jī)相比例小于等于去除緩沖鹽的起始流動(dòng)相體系。

與檢測(cè)器匹配

對(duì)于紫外檢測(cè)器，需要考慮溶劑在紫外波段的吸收，所用的溶劑的截止波長(zhǎng)應(yīng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)，保證在所選擇的檢測(cè)波長(zhǎng)下，溶劑無(wú)吸收或者吸收較小。對(duì)于示差檢測(cè)器，需要考慮溶劑的折射率，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)高靈敏度。

附常用溶劑性質(zhì)