微生物數(shù)量的測定——顯微鏡直接計數(shù)法！

細(xì)菌群體生長表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或細(xì)胞物質(zhì)的增加。測定細(xì)胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidityestimation by spectrophotometer)、最大或然數(shù)法(most probable number MPN)以及膜過濾法(membrane filtration)等。測定細(xì)胞物質(zhì)的方法有細(xì)胞干重的測定，細(xì)胞某種成分如氮的含量、RNA 和DNA 的含量測定，代謝產(chǎn)物的測定等?？傊?，測定微生物生長量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，工作中應(yīng)根據(jù)具體情況要求加以選擇。本實驗主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計數(shù)法。

一、目的要求

1、明確血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)的原理。

2、掌握使用血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行微生物計數(shù)的方法。

二、基本原理

顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內(nèi)外常用的計菌器有：血細(xì)胞計數(shù)板、Peteroff-Hauser 計菌器以及Hawksley 計菌器等，它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計數(shù)，基本原理相同。后兩種計菌器由于蓋上蓋玻片后，總?cè)莘e為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計數(shù)。除了用這些計菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細(xì)菌學(xué)檢查。顯微鏡直接計數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點(diǎn)是所測得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點(diǎn)，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時間）以及加細(xì)胞分裂抑制劑等方法來達(dá)到只計數(shù)活菌體的目的。

本實驗以血球計數(shù)板為例進(jìn)行顯微鏡直接計數(shù)。另外兩種計菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。用血細(xì)胞計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)是一種常用的微生物計數(shù)方法。該計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。血細(xì)胞計數(shù)板構(gòu)造如圖l5-1。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成25 個中方格，而每個中方格又分成16 個小方格(圖15-2)；另一種是一個大方格分成16 個中方格，而每個中方格又分成25 個小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格都是400 個。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計數(shù)室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。圖15—1 血細(xì)胞計數(shù)板構(gòu)造（一） 圖15—2 血細(xì)胞計數(shù)板構(gòu)造（二）A. 正面圖；B.縱切面圖； 放大后的方格網(wǎng)，中間大方格為計數(shù)室1.血細(xì)胞計數(shù)板；2. 蓋玻片；3.計數(shù)室計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25 或16，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml 菌液中的總菌數(shù)。設(shè)五個中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25 個中方格的計數(shù)板，則1mL 菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B（個）同理，如果是16 個中方格的計數(shù)板，1mL 菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A·B（個）

三、器材

1、菌種

釀酒酵母

2、儀器或其他用具

血細(xì)胞計數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細(xì)滴管。

四、操作步驟

1、菌懸液制備

以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?/span>

2、鏡檢計數(shù)室

在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計數(shù)。

3、加樣品

將清潔干燥的血細(xì)胞計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動進(jìn)入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。取樣時先要搖勻菌液；加樣時計數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。

4、顯微鏡計數(shù)

加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計數(shù)。調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10 個菌體為宜。每個計數(shù)室選5 個中格(可選4 個角和中央的一個中格)中的菌體進(jìn)行計數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時，即作為兩個菌體計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算樣品的含菌量。

5、清洗血細(xì)胞計數(shù)板

使用完畢后，將血細(xì)胞計數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。

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