液相方法開發(fā)攻略
彈：實現(xiàn)保留
今天要為大家?guī)硪粋€新干貨系列——液相方法開發(fā)攻略！
在進行液相色譜分析時，我們通常有以下訴求：
而在液相分析工作中，液相方法的開發(fā)一直是一項比較具有難度的工作，不論是新手小白，還是有經(jīng)驗的實驗室老師，在面對新項目的方法開發(fā)時，總會遇到一些問題。
因此，YoYo特意把大曹三耀技術(shù)中心多年來積累總結(jié)的經(jīng)驗，梳理匯總為這一系列液相方法開發(fā)攻略，并將圍繞以下四個方面展開介紹：
★ 實現(xiàn)保留
★ 實現(xiàn)分離
★ 峰形和理論塔板數(shù)
★ 壽命
今天先來介紹重要也是關(guān)鍵的彈——實現(xiàn)保留，后續(xù)幾篇將在今后陸續(xù)推送，敬請期待喲~
由于大部分化合物都可以在反相分析模式下，使用反相C18色譜柱進行分析與保留，因此，在建立新方法時，反相C18色譜柱也是優(yōu)先選擇的色譜柱。一般可以按照以下步驟進行調(diào)整：
反相C18柱初篩 看是否有保留
提問：方法初篩時，選擇什么樣的C18色譜柱比較好？
YoYo老師：選擇一款普適型色譜柱，要求硅膠純度高、金屬雜質(zhì)低、具有適中的疏水性與表面極性，能分析大多數(shù)常規(guī)化合物，峰形好、壽命長，分離度高，柱效高~
這些要求很過分嗎？不！
這是我們對CAPCELL PAK C18 MGII色譜柱的基本要求！
CAPCELL PAK C18 MGII
CAPCELL PAK C18 MG系列色譜柱憑借填料表面致密的聚合物包被技術(shù)，極大程度地抑制了硅膠基材的金屬雜質(zhì)及殘留硅醇基等不良影響，CAPCELL PAK系列色譜柱具有以下特長：
★ 極大限度地減少配位化合物的吸附
★ 極大限度地抑制殘留硅醇基的二次效應(yīng)
★ 優(yōu)越的耐酸、耐堿性能
★ 能得到對稱性良好的色譜峰
★ 具備良好的保留與分離能力
其中，CAPCELL PAK C18 MGII色譜柱是普適性很強的C18色譜柱，可以滿足大部分化合物的分析需求。
那么，在經(jīng)過C18色譜柱初篩之后，還是發(fā)生了保留不充分的情況，應(yīng)該如何調(diào)整分析方法來實現(xiàn)保留呢？
1
調(diào)整pH值
在反相模式下，對于不同性質(zhì)的化合物也應(yīng)采取不同的流動相條件及相應(yīng)色譜柱。例如，酸性化合物在酸性條件下保留較強，堿性化合物在堿性條件下保留較強，利用這一性質(zhì)，調(diào)整適合的pH值，并選擇相應(yīng)適合的色譜柱，即可達到良好保留結(jié)果。
在設(shè)定流動相pH時需要注意：離子性化合物可能會由于流動相pH值設(shè)定的不合理而發(fā)生漂移，建議將流動相的pH值設(shè)定在化合物的pKa±2以上范圍。
2
更換保留模式
如果調(diào)整流動相pH也不能解決保留問題，該化合物可能不適合在反相模式下進行保留和分析，這時，可以考慮更換保留模式進行進一步的方法摸索。
★ 離子交換模式（離子對試劑、離子交換柱）
★ HILIC模式
★ 正相模式
色譜柱的選擇
對于強極性、小分子類化合物，可以使用高極性反相柱或在HILIC模式下進行保留嘗試
★ 高極性反相柱：AQ、ADME
★ HILIC（親水性相互作用）柱：PC HILIC、NH2、SILICA
對于酸性化合物，可以使用陰離子交換柱或反相柱+正離子對試劑的方法，使酸性化合物處于分子態(tài)，利于增強保留
★ 陰離子交換柱：NH2
★ 反相柱+正離子對試劑：C18 MG、C18 MGII、SPOLAR C18
對于堿性化合物和兩性化合物，可以嘗試使用陽離子交換柱或反相柱+負離子對試劑的方法，使堿性化合物處于分子態(tài)，增強保留
★ 陽離子交換柱：SCX、CR
★ 反相柱+負離子對試劑：C18 MG、C18 MGII、SPOLAR C18
分離模式選擇例
接下來，YoYo將以三聚氰胺的分析為例，對保留困難的化合物的方法建立進行說明。
三聚氰胺俗稱蜜胺、蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，為重要的氮雜環(huán)有機化工原料，有毒，不可用作食品加工和食品添加劑，pKa=8，屬于弱堿性化合物。
三聚氰胺
Melamine
M.W. :126.12
（一）離子交換模式
在離子交換模式下進行分析，能對三聚氰胺得到良好保留。具體做法可分為以下兩種：
1. 反相色譜柱 + 離子對試劑
▲CAPCELL PAK C18 MG+離子對試劑
HPLC Conditions (Refer to GB/T 22388-2008):
Column: CAPCELL PAK C18 MG S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm
M.Phase: 10 mM citric acid, 10mM SOS (pH 3.0 adjusted with NaOH) / CH3CN = 90 / 10
Flow rate: 1 mL/min
Oven Temp.: 40°C
Detector: UV 240 nm
Sample: Melamine in M.P.
Inj. Vol.: 20 μL
2. 離子交換色譜柱分析
▲CAPCELL PAK SCX色譜柱
HPLC Conditions:
Column: CAPCELL PAK SCX UG80 S5; 4.6 mm i.d. × 150 mm
M.Phase: 50 mM KH2PO4 (pH 3.0 adjusted with H3PO4) / CH3CN = 70 / 30
Flow rate: 1 mL/min
Oven Temp.: 30°C
Detector: UV 240 nm
Sample: Melamine in M.P.
Inj. Vol.: 20 μL
CAPCELL PAK SCX
CAPCELL PAK SCX是一款解決了傳統(tǒng)硅膠系離子交換柱存在的問題的聚合物包被型強陽離子交換色譜柱。在精密分級的5 μm的高純度硅膠上形成高分子聚合物包被后，導入磺酸基。聚合物包被型的Si-C結(jié)合比一般的化學結(jié)合型硅膠系SCX的Si-O-Si結(jié)合更穩(wěn)定，耐久性更強。
★ 通過強陽離子交換作用和疏水性相互作用的共同保留機制來進行保留
★ 批次間重現(xiàn)性良好
★ 耐久性強
不論是反相柱+離子對試劑，還是使用離子交換色譜柱進行分析，都會發(fā)現(xiàn)色譜柱平衡時間對保留時間的影響。在離子交換模式下進行分析時，需要充分平衡色譜柱，建議小流速過夜平衡，可以得到比較穩(wěn)定的實驗結(jié)果。
（二）高極性反相色譜柱
鍵合金剛烷基團的CAPCELL PAK ADME色譜柱，兼具高表面極性和一定的疏水性，不僅適用于強極性物質(zhì)的保留，也適用于強極性物質(zhì)和疏水性物質(zhì)的多組分共同分析。
使用鍵合獨特金剛烷基團的CAPCELL PAK ADME色譜柱，在簡單的2%甲醇條件下即可實現(xiàn)三聚氰胺和雙氰胺的良好保留與分離。這得益于ADME色譜柱獨特的表面極性與保留模式。
▲CAPCELL PAK ADME分析三聚氰胺與雙氰胺結(jié)果
*峰1：雙氰胺，峰2：三聚氰胺
HPLC Conditions:
色譜柱：CAPCELL PAK ADME S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm
流動相：2% CH3OH
流 速：1000µL / min
溫 度：35°C
檢 測：PDA210 nm
進樣量：5 µL
樣 品：10 μg/mL（流動相溶解稀釋）
CAPCELL PAK ADME
CAPCELL PAK ADME色譜柱采用獨特的立體籠狀金剛烷基官能團——ADME官能團，突破了以C18官能團為主的傳統(tǒng)柱在反相保留機理中的可分析化合物的限制，使可分析化合物的極性范圍得到了巨大的提升；并且，在極性提升的同時還兼顧一定的疏水性；從而，包含從強極性化合物到疏水性化合物的復雜組分樣品在ADME上也能同時得到良好的保留。
★ 立體籠狀金剛烷基官能團——獨特的獨特的表面極性與疏水性平衡
★ 高表面極性——對強極性化合物的良好保留
★ 兼顧一定疏水性——從極性到疏水性化合物的共同分析
★ 立體選擇性——空間異構(gòu)體拆分能力
ADME(adamantane)金剛烷，我們將這種籠狀結(jié)構(gòu)的金剛烷基團以控制的鍵合密度導入填料表面，通過“新型官能團”和特有的包被型填料表面“控制技術(shù)”，我們將保持疏水性又提高表面極性變?yōu)榭赡?；由于金剛烷特有的籠狀結(jié)構(gòu)所帶來的立體選擇性，還賦予了ADME分離結(jié)構(gòu)類似化合物的能力。
（三）親水性相互作用 HILIC模式
親水性相互作用色譜法（HILIC）是針對在常規(guī)C18色譜柱上保留較弱的強親水性物質(zhì)的保留方法。在HILIC模式下，通過鍵合極性官能團的固定相與反相模式常用的CH3CN / H2O系流動相條件相組合，對親水性化合物進行保留與分離。因此，HILIC是在HPLC的分離模式中常使用的反相模式的反相，故也被稱為“反反相模式”。
大阪曹達獨立研發(fā)合成了構(gòu)成細胞膜的主要磷脂類物質(zhì)之一的卵磷脂親水性部位——PC基團（磷酸膽堿基團），作為PC HILIC色譜柱的官能團，對親水性化合物的保留具有優(yōu)勢。
如下圖，使用PC HILIC色譜柱和另一款其他品牌色譜柱Column B進行對比，對三聚氰胺進行分析，在10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10（pH = 3.0）條件下，PC HILIC色譜柱所得保留時間更長，理論塔板數(shù)更高，即使是在水相比例為20%時，也得到了足夠的保留。
▲PC HILIC色譜柱在不同條件下分析結(jié)果
HPLC Conditions：
Column : PC HILIC 4.6 mm i.d. x 250 mm
Mobile phase : 10 mmol/L HCOONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10, pH = 3.0
Flow rate : 1.0 mL/min
Temperature : 40 ?C
Detection : UV 235 nm
Inj. vol. : 10 μL
Sample dissolved in: Mobile phase
PC HILIC
大阪曹達獨立研發(fā)合成了構(gòu)成細胞膜的主要磷脂類物質(zhì)之一的卵磷脂親水性部位——PC基團（磷酸膽堿基團），作為PC HILIC色譜柱的官能團，對親水性化合物的保留具有優(yōu)勢。
★使用超親水性的磷酸膽堿基團作為官能團的HILIC色譜柱
★隨乙腈含量增加，保留增大，通常70%乙腈
（四）LC-MS分析——混合模式保留
MS檢測對流動相的要求：
★ 不含離子對試劑
★ 揮發(fā)性鹽，低濃度
陽離子交換填料柱 + 揮發(fā)性鹽溶液（低濃度）
SCX + C18 = CR ！
在以MS檢測器進行分析時，流動相條件會對靈敏度產(chǎn)生很大影響，CAPCELL PAK CR色譜柱混合了C18和強陽離子交換SCX填料，即使對多種堿性化合物進行同時分析，也能兼顧對保留和MS檢測靈敏度的要求。
如上圖，在中性條件下：
● C18色譜柱：中性化合物得到保留，酸性、堿性化合物快速出峰；
● SCX色譜柱：堿性化合物得到保留，中性、酸性化合物快速出峰；
● 混合了兩種填料的CR色譜柱：堿性化合物得到保留，中性化合物能得到適度保留，酸性化合物依然快速出峰。
此時，只需將流動相條件調(diào)整為酸性，即可在CR色譜柱上同時保留這三種類型的化合物：
HPLC Conditions：
Column ：CAPCELL PAK CR S5 1:4 ; 2.0 mm i.d. × 150 mm
Mobile Phase：1.0 vol% CH3COOH,
25 mmol/L CH3COONH4 / CH3CN = 50 / 50
Flow rate ：200 µL/min
Temp ：40 ℃
Detection ：UV 240 nm
Injection ：2 µL
Sample ：10 µg/mL
CAPCELL PAK CR
CAPCELL PAK CR色譜柱是一款混合C18和強陽離子交換SCX填料的色譜柱。對多種堿性化合物進行同時分析時，能同時兼顧對保留和MS檢測靈敏度的要求。
★ 強陽離子交換SCX與C18混合填料
★ 具有獨特分離模式
★ 適合于LC-MS的高靈敏度離子化合物分析
★ 可對酸性、中性、堿性化合物進行同時保留
★ 有3種混合比例可供選擇
*與武田制藥共同開發(fā)
通過調(diào)整流動相的鹽濃度，可在離子交換作用下針對堿性化合物的保留程度進行調(diào)整，從而改變分離模式，達到不同極性化合物同時分析的效果。
1、 色譜柱老化的目的：是徹底除去填充物中的殘留溶劑和某些揮發(fā)性的物質(zhì)；另一方面是促進固定液均勻牢固地分布在擔體的表面上。 而且新的氣相色譜柱必須老化。
2、 方法：在常溫下使用的色譜柱，可直接裝在色譜儀上，接通載氣，沖至基線平穩(wěn)即可使用；如果色譜柱在高溫操作條件下應(yīng)用，則在比操作溫度稍高的溫度下通載氣幾小時至幾十小時，徹底沖出固定液中易揮發(fā)的物質(zhì)，到基線平穩(wěn)后即可投入使用。不同的色譜柱老化方法也不同。具體方法如下：
色譜柱
一、毛細管柱
確保載氣流過毛細管柱 15-30分鐘。
緩慢程序升溫(5º/min)到老化溫度。
zui初老化溫度 ≥ 4 hours。
如果柱子受到污染, 可在推薦的zui高色譜柱溫度低20 ºC的條件下，老化柱子。
一般推薦的老化溫度為：
Tcond = Tmax/2 - Tapp/2 + Tapp
這里:
Tcond = 老化溫度
Tmax = 色譜柱推薦采用的zui高溫度
Tapp = 應(yīng)用中使用的zui高溫度
在老化柱子時，一定不要將毛細管接在檢測器上。應(yīng)將那一端放空，同時將檢測器用悶頭堵上。如果是FID,容許接在上面，但應(yīng)該將檢測器溫度升上去。
二、填充柱
將柱子接通載氣，流速5～10ml/min，在高于使用溫度5～10℃(但必須低于柱子使用限制溫度)下老化8～24小時，目的是去除裝柱時的殘留溶劑，使固定液分布均勻，提高柱效。老化時必須將柱子與檢測器的連接斷開以免污染檢測器
一般不需要買一個專門的色譜柱老化箱，色譜柱老化當然放在色譜柱溫箱內(nèi)。
氮氣作為載氣，在色譜管路中是流動的，無論是老化色譜柱還是分析實驗中，氮氣都是放空到空氣中的，色譜檢測器比如FID的噴嘴，本來就是中空的，檢測過程 中燃燒的只是氫氣和助燃氣（空氣或氧氣），氮氣從噴嘴中出來就放空了，所以不存在柱溫箱內(nèi)聚集的問題。還有，在色譜柱老化時，因不需要點火，所以氫氣和空 氣都不用開。
但有另外一種情況，所使用的檢測器是TCD（熱導池檢測器）時，國內(nèi)一般使用氫氣做載氣，這時應(yīng)特別注意，如果柱溫箱內(nèi)載氣流路漏氣，將會在柱溫箱內(nèi)集聚 氫氣，其實氫氣在柱溫箱內(nèi)爆炸的事以前是常有的事。所以如果是這種情況，建議老化色譜柱時更換成氮氣或購買專門的老化箱進行老化。
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