、準備好工具和所需部件。工具包括扳手、超聲清洗器、密封圈安靜工具、新密封圈。用水-甲醇沖洗泵，拆開進出口管道，在泵頭和單向閥上標出液流方向。
第二、將柱塞桿縮至小，松開泵頭的收緊螺釘，小心托住泵頭。操作時要注意處處以平衡的動作慢慢退出泵頭，切不可搖動或上下左右擺動泵頭。
第三、從密封圈孔中輕輕拔出舊密封圈，注意不要化泵頭內壁，要毫不猶豫地隨即扔掉舊密封圈。
第四、將泵頭和新密封圈分別放入甲醇中超聲清洗，同時用無纖維紙擦洗柱塞桿。察看柱塞桿上有無劃痕，如有劃痕應換新柱塞桿然后再安裝密封圈，
第五、安裝新密封圈。這一步要用專門的安裝工具，切不可粗心大意，避免損壞密封圈。
第六、重新裝上泵頭。先在柱塞桿上滴幾滴甲醇以濕潤，滑動泵頭到位。千萬不能搖動或擺動，以防柱塞桿在這一步操作時折斷。平衡地上緊固定螺絲，接上進液管道。
后、打脫氣甲醇到泵腔中，不斷用紙巾從泵出口處吸去流出的液體，等到無氣泡一處再接上輸出管道，打開放空閥，繼續(xù)抽20mL甲醇趕走氣泡后，換成需要使用的流動相。
Agilent液相色譜儀標準操作程序
1.目的：建立一個液相色譜的標準操作程序。
2.范圍：適用于Agilent液相的使用。
3.責任：使用Agilent液相的化驗員。
4.程序
4.1工作環(huán)境
實驗室溫度為20～27℃，溫度變化<3℃/hr，相對濕度<80%，液相色譜儀工作臺，長2米、寬0.8米、承重大于80公斤，離墻距離0.3米以上。單相交流220V，（+5%～10%），50～60Hz，有單獨的良好接地。配置穩(wěn)壓電源，功率大于2.5千瓦。
4.2使用前的準備
4.2.1二次蒸餾水，（建議用0.45微米水相濾膜過濾）；甲醇或乙晴（色譜純），（建議用0.45微米有機相濾膜過濾）；其他樣品所需流動相，（都需經(jīng)過0.45微米濾膜過濾）。將上述溶劑放入超聲波池，除去氣泡，方可使用。
4.2.2把流動相放入溶劑瓶中，打開purge閥，單擊pump圖標，出現(xiàn)參數(shù)設定菜單，單擊setup選項，進入pump編輯畫面，設flow：5ml/min，單擊OK；單擊pump圖標，出現(xiàn)參數(shù)設定菜單，單擊pump control選項，選中ON，單擊OK，則系統(tǒng)開始purge，直到管線內（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止，切換通道繼續(xù)purge，直到所有要用通道無氣泡為止；單擊pump圖標，出現(xiàn)參數(shù)設定菜單，單擊setup選項，進入pump編輯畫面，設flow：1.0ml/min，關閉purge valve。單擊pump下的的瓶圖標，輸入溶劑的實際體積和瓶體積，也可輸入阻止分析和關泵的體積，單擊OK。
4.2.3進行樣品前處理（稀釋或溶解至所需濃度）。
4.3實驗步驟
4.3.1準備
4.3.1.1開啟Agilent 1100LC各模塊電源。
4.3.1.2打開計算機，雙擊online圖標。
4.3.1.3從"view"菜單中選擇"method and run control"畫面，單擊"view"菜單中的"show top toolbar","show status toolbar","system diagram","sampling diagram"使其命令前有"√"標志。
4.3.2數(shù)據(jù)采集方法編輯
4.3.2.1從“method"菜單中選擇"edit entire method"項，選中除"data analysis"外的三項，單擊OK，進入下一畫面。
4.3.2.2在"method comments"中加入方法的信息（如This is for test!），單擊OK進入下一畫面。
4.3.2.3泵參數(shù)設定
在"flow"處輸入流量1ml/min，在"solvent"處輸入流動相中各溶劑所占的比例，也可"insert"一行"timetable",編輯梯度。在"pressure limits max"處輸入柱子的zui大耐高壓，以保護柱子，單擊OK進入下一畫面。
4.3.2.4柱溫箱參數(shù)設定
在"temperature"下面的方框內輸入所需的溫度，并選中它點擊"more>>"鍵，如圖所示，選中"same as left"使柱溫箱的溫度左右一致，點擊OK進入下一畫面。
4.3.2.5 VWD檢測器參數(shù)設定
在"wavelength"下方的空白處輸入所需的檢測波長，在"peak width(response time)"下方點擊下拉式三角框，選擇合適的響應時間，如>0.1min 。 在"timetable"中可以"insert"一行，可以輸入隨時間切換的波長。
4.3.2.6在"run time checklist"中，選中"data acquisition"，單擊OK。
4.3.2.7單擊“method"菜單，選中"save method as"，輸入一方法名，單擊OK。
4.3.2.8從"run control"菜單中選擇"sample info"選項，輸入操作者姓名，在"data file"中選擇"manual"或"prefix"。
4.3.2.9從"instrument"菜單中，選擇"system on"。
4.3.2.10單擊OK，等儀器ready，基線平穩(wěn)，從"method"菜單中選擇"run method"，進樣。
4.3.2.11進樣時，閥門位置處于"inject"位置，進樣針取樣量應為所規(guī)定體積的三倍，用濾紙拭凈針頭表面殘留液，進樣時要輕而快，進樣完畢應快速將閥門搬至"load"位置，進樣完畢，數(shù)分鐘后將進樣針拔下，閥門回復到"inject"位置。 4.3.3數(shù)據(jù)分析方法編輯
4.3.3.1從"view"菜單中，單擊"data analysis"進入數(shù)據(jù)分析畫面。
4.3.3.2從"file"菜單中選擇"load signal"選項，選中您的數(shù)據(jù)文件，單擊OK。
4.3.3.3做譜圖優(yōu)化，從"graphics"菜單中選擇"signal options"選項，從"ranges"中選擇"auto scale"及合適的顯示時間，單擊OK，或選擇"use ranges"調整。反復進行，直到圖的比例合適為止。
4.3.3.4積分
4.3.3.4.1從"integration"中選擇"auto integrate"，如積分結果不理想，再從菜單中選擇"integration events"選項，選擇合適的"slope sensitivity","peak width","area reject","height reject"。
4.3.3.4.2從"integration"菜單中選擇"integrate"選項，則數(shù)據(jù)被積分。
4.3.3.4.3如積分結果不理想，則重復上兩步動作，直到滿意為止。
4.3.3.4.4單擊左邊"√"圖標，將積分參數(shù)存入方法。
4.3.3.5打印報告
4.3.3.5.1從"report"菜單中選擇"specify report"選項，進入。
4.3.3.5.2單擊"quantitative results"框中"calculate"右側的黑三角，選擇所需的報告形式，其他選項不變，單擊OK。
4.3.3.5.3從"report"菜單中選擇"print report"，則報告結果將打印到屏幕上，如想輸出到打印機上，則單擊"report"底部的"print"鈕。
4.3.4關機
4.3.4.1關機前，先用水和有機溶劑對系統(tǒng)進行梯度沖洗，然后再用有機溶劑沖洗系統(tǒng)，然后關泵（適用于反相色譜柱）。[正相色譜柱用適當?shù)娜軇_洗]
4.3.4.2退出化學工作站，及其他窗口。
4.3.4.3關掉Agilent1100電源開關，計算機（用shut down關）。
4.4.1色譜柱長時間不用，存放時，柱內應充滿溶劑，兩端封死。
4.4.2對于手動進樣器，當使用緩沖液時，要用水沖洗進樣口，同時搬動進樣閥數(shù)次。
4.4.3流動相使用前必須過濾、超聲，不能使用多日存放的純化水（易長菌），應每天更換純化水。
液相色譜系統(tǒng)的許多問題都能在譜圖上反映出來。其中有一些問題可以通過改變設備參數(shù)得到解決；而有些問題必須通過修改操作程序來解決。本文匯總了一些關于液相色譜圖譜問題的解決辦法，這些辦法也許能更有效的幫你解決問題。
1峰拖尾
原因和解決方法
1、篩板阻塞
a、反沖色譜柱
b、更換進口篩板
c、更換色譜柱
2、色譜柱塌陷
填充色譜柱
3、干擾峰
a、使用更長的色譜柱
b、改變流動相或更換色譜柱
4、流動相PH選擇錯誤
調整PH值。對于堿性化合物，低PH值更有利于得到對稱峰
5、樣品與填料表面的溶化點發(fā)生反應
a、加入離子對試劑或堿性揮發(fā)性修飾劑
b、更改色譜柱
2峰前延
原因和解決方法
1、柱溫低
升高柱溫
2、樣品溶劑選擇不恰當
使用流動相作為樣品溶劑
3、樣品過載
降低樣品含量
4、色譜柱損壞
更換色譜柱
3峰分叉
原因和解決方法
1、 保護柱或分析柱污染
取下保護柱再進行分析。如果必要更換保護柱。如果分析柱阻塞，拆下來清洗。如果問題仍然存在，可能是柱子被強保留物質污染，運用適當?shù)脑偕胧Ｈ绻麊栴}仍然存在，入口可能被阻塞，更換篩板或更換色譜柱。
2、樣品溶劑不溶于流動相
改變樣品溶劑。如果可能采取流動相作為樣品溶劑。
4峰變形
原因和解決方法
1、樣品過載
減少樣品載量
5早出的峰變形
原因和解決方法
1、樣品溶劑選擇不恰當
a、減少進樣體積
b、運用低極性樣品溶劑
6早出峰拖尾程度大于晚出峰
原因和解決方法
1、柱外效應
a、調整系統(tǒng)連接（使用更短、內徑更小的管路）
b、使用小體積的流通池
7K’增加時，脫尾更嚴重
原因和解決方法
1、二級保留效應，反相模式
a、加入三乙胺（或堿性樣品）
b、加入乙酸（或酸性樣品）
c、加入鹽或緩沖劑（或離子化樣品）
d、更換一支柱子
2、二級保留效應，正相模式
a、加入三乙胺（或堿性樣品）
b、加入乙酸（或酸性樣品）
c、加入水（或多官能團化合物）
d、試用另一種方法
3、二級保留效應，離子對
加入三乙胺（或堿性樣品）
8酸性或堿性化合物的峰拖尾
原因和解決方法
1、緩沖不合適
a、使用濃度50-100mM的緩沖液
b、使用Pka等于流動相PH值的緩沖液
9額外的峰
原因和解決方法
1、樣品中有其他組份
2、前一次進樣的洗脫峰
a、增加運行時間或梯度斜率
b、提高流速
3、空位或鬼峰
a、檢查流動相是否純凈
b、使用流動相作為樣品溶劑
c、減少進樣體積
10保留時間波動
原因和解決方法
1、溫控不當
調好柱溫
2、流動相組分變化
防止變化（蒸發(fā)、反應等）
3、色譜柱沒有平衡
在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱
11保留時間不斷變化
原因和解決方法
1、流速變化
重新設定流速
2、泵中有氣泡
從泵中除去氣泡
3、流動相選擇不恰當
a、更換合適的流動相
b、選擇合適的混合流動相
12基線漂移
原因和解決方法
1、柱溫波動
控制好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器
2、流動相不均勻
（流動相條件變化引起的基線漂移大于溫度導致的漂移。）
使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進行脫氣，使用中使用氦氣。
3、流通池被污染或有氣體
用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用鹽酸）
4、檢測器出口阻塞
（高壓造成流通池窗口破裂，產(chǎn)生噪音基線）
取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。
5、流動相配比不當或流速變化
更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。
6、柱平衡慢，特別是流動相發(fā)生變化時
用中等強度的溶劑進行沖洗，更改流動相時，在分析前用10-20倍體積的新流動相對柱子進行沖洗。
7、流動相污染、變質或由低品質溶劑配成
檢查流動相的組成。使用高品質的化學試劑及HPLC級的溶劑
8、樣品中有強保留的物質（高K’值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個逐步升高的基線。
使用保護柱，如有必要，在進樣之間或在分析過程中，定期用強溶劑沖洗柱子。
9、使用循環(huán)溶劑，但檢測器未調整
重新設定基線。當檢測器動力學范圍發(fā)生變化時，使用新的流動相。
10、檢測器沒有設定在最大吸收波長處
將波長調整至最大吸收波長處
13基線噪音（規(guī)則的）
原因和解決方法
1、在流動相、檢測器或泵中有空氣
流動相脫氣。沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣。
2、漏液
檢查管路接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。
3、流動相混合不完全
用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑
4、溫度影響（柱溫過高，檢測器未加熱）
減少差異或加上熱交換器
5、在同一條線上有其他電子設備
斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查干擾是否來自于外部，加以更正。
6、泵振動
在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器
14基線噪音
原因和解決方法
1、 漏液
檢查接頭是否松動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封。檢查流通池是否漏液。
2、流動相污染、變質或由低質溶劑配成
檢查流動相的組成。
3、流動相各溶劑不相溶
選擇互溶的流動相
4、檢測器/記錄儀電子元件的問題
斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查并更正。
5、系統(tǒng)內有氣泡
用強極性溶液清洗系統(tǒng)
6、檢測器內有氣泡
清洗檢測器，在檢測器后面安裝背景壓力調節(jié)器
7、流通池污染
（即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音。）
用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池
8、檢測器燈能量不足
更換燈
9、色譜柱填料流失或阻塞
更換色譜柱
10、流動相混合不均勻或混合器工作不正常
維修或更換混合器，在流動相不走梯度時，建議不使用泵的混合裝置
15寬峰
原因和解決方法
1、流動相組成變化
重新制備新的流動相
2、流動相流速太低
調節(jié)流速
3、漏液（特別是在柱子和檢測器之間）
檢查接頭是否松動、泵是否漏液、是否有鹽析出以及不正常的噪音。如果必要更換密封。
4、檢測器設定不正確
調整設定
5、柱外效應影響
a、柱子過載
b、檢測器對反應時間或池體積響應過大
c、柱子與檢測器之間的管路太長或管路內徑太大
d、記錄儀響應時間太長
6、緩沖液濃度太低
增加濃度
7、保護柱污染或失效
更換保護柱
8、色譜柱污染或失效，塔板數(shù)較低
更換同樣類型的色譜柱。如果新柱子可以提供對稱的色譜峰，則用強溶劑沖洗舊柱子。
9、柱入口塌陷
打開柱入口，填補塌陷或更換柱子
10、呈現(xiàn)兩個或多個未被完全分離的物質的峰
選擇其它類型的色譜柱以改善分離效果
11、柱溫過低
提高柱溫。除非特殊情況，溫度不宜超過75℃
12、檢測器時間常數(shù)太大
使用較小的時間常數(shù)
16分離度降低
原因和解決方法
1、流動相污染或變質（引起保留時間變化）
重新配置流動相
2、保護柱或分析柱阻塞
去掉保護柱進行分析。如果必要則更換保護柱。如果分析柱阻塞，可進行反沖。如果問題仍然存在色譜柱可能被強保留的污染物損壞，建議使用恰當?shù)脑偕绦?。如果問題仍然存在，進口可能阻塞了，更換入口處的篩板或更換色譜柱。
17所有的峰面積都太小
原因和解決方法
1、檢測器衰減設定過高
減少衰減的設定
2、檢測器時間常數(shù)設定太大
設定較小的時間常數(shù)
3、進樣量太少
增大進樣量
4、記錄儀連接不當
使用正確的連接
18所有的峰面積都太大
原因和解決方法
1、檢測器衰減設定過低
采取較大的衰減
2、進樣過多
減少進樣量
3、記錄儀連接不正確
正確連接記錄儀
449717568