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三重混合模式色譜柱選賽默飛色譜柱準(zhǔn)沒錯(cuò) 色譜柱常見問題解決方法

時(shí)間:2020-07-24    來源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     

 

說到混合型液相色譜柱,它是一種能夠發(fā)生多種相互作用模式的色譜柱,作為色譜分離的核心,在目前的液相色譜分析中發(fā)揮著重要的作用。混合模式的色譜柱也是種類繁多,有雙重混合模式的,也有三重混合模式的。雙重混合模式包括:反相+陽離子交換,反相+陰離子交換,反相+HILIC等。三重混合模式包括:反相+陽離子交換+陰離子交換,HILIC+陽離子交換+陰離子交換等。

 

混合模式色譜柱由于其多種優(yōu)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)人員在分離復(fù)雜樣品時(shí),越來越多的被使用到實(shí)驗(yàn)中,賽默飛擁有的三重混合模式Trinity系列色譜柱在單次運(yùn)行中可同時(shí)分離離子和疏水性分析物,消除了更換色譜柱,使用離子對(duì)或使用多種色譜填料的需要。

 

來來來

 

我們來隆重介紹一下Acclaim Trinity系列色譜柱。Acclaim Trinity系列均為三重混合模式的色譜柱。又分為P和Q兩個(gè)系列,均采用納米微球-硅膠雜化技術(shù),一個(gè)顆粒上集成了三種分離模式。P系列色譜柱可以同時(shí)分離陽離子、陰離子和非極性化合物。Q系列先賣個(gè)關(guān)子~

 

  圖1. 納米微球-硅膠雜化技術(shù)

(點(diǎn)擊查看大圖)

 

新型Nanopolymer Silica Hybrid(NSH)技術(shù)在對(duì)以下物質(zhì)分離時(shí)可以獲得無可比擬的色譜性能:

01

原料藥和反離子

02

藥物反離子的篩選

03

酸性和堿性原料藥及各自反離子的混合物

04

酸性、堿性和中性原料藥的混合物

 

圖2. Trinity P1柱和Trinity P2柱對(duì)比

(點(diǎn)擊查看大圖)

 

使用與維護(hù)

 

當(dāng)次使用新的色譜柱時(shí),在進(jìn)行任何進(jìn)樣之前,應(yīng)采用流動(dòng)相進(jìn)行徹底沖洗(例如,在推薦的流速,大約使用 20 柱體積)。

 

當(dāng)切換到新的流動(dòng)相時(shí), 確保新的流動(dòng)相與色譜柱中以前的流動(dòng)相相容,以避免由于沉淀造成色譜柱堵塞。在進(jìn)行任何進(jìn)樣(例如 20 個(gè)柱體積)之前,應(yīng)完全調(diào)節(jié)色譜柱。

 

使用色譜柱前,需要把系統(tǒng)里置換為含有鹽的水相和有機(jī)相。保證色譜柱一直在帶有緩沖鹽的體系下使用,是對(duì)色譜柱較好的維護(hù)。

 

色譜柱清洗

 

對(duì)于磷酸鹽緩沖液中使用的 3.0 mm 內(nèi)徑色譜柱:

1

在 0.3 mL/min 流速時(shí),使用 5 個(gè)柱體積的 20 mM 磷酸鈉(或鉀)緩沖液, pH 值 6 / 乙腈 v/v 50/50 清洗色譜柱。

2

在 0.3 mL/min 流速時(shí),使用 20 個(gè)柱體積的 100 mM 磷酸鈉(或鉀)緩沖液, pH 值 6 / 乙腈 v/v 90/10 清洗色譜柱(以強(qiáng)力清除滯留的離子物)。

3

在 0.3 mL/min 流速時(shí),使用 5 個(gè)柱體積的 10 mM 磷酸鈉(或鉀)緩沖液, pH 值 6 / 乙腈 v/v 50/50 清洗色譜柱。

4

在 0.3 mL/min 流速時(shí),使用 20 個(gè)柱體積的 10 mM 磷酸鈉(或鉀)緩沖液, pH 值 6.4 / 乙腈 v/v 20/80 清洗色譜柱(以強(qiáng)力清除滯留的疏水污染物)。

5

使用至少 20 個(gè)柱體積流動(dòng)相平衡色譜柱。

 

典型應(yīng)用

 

圖3. Trinity P1柱分析氯酸鹽和高氯酸鹽

 

圖4.Trinity P1同時(shí)分離藥物反離子

 

圖5.Trinity P2柱分析藥物相關(guān)陰離子和陽離子

 

  今天有人問,《色譜柱使用記錄》表里樣品進(jìn)樣針數(shù)后面為什么還有個(gè)累計(jì)進(jìn)樣針數(shù)?
 
  套用哲學(xué)觀點(diǎn),任何物質(zhì)都是有壽命的,大到宇宙,小到原子,但是不同的物質(zhì)壽命是不一樣的。
 
  每一根色譜柱都有一個(gè)大致的進(jìn)樣針數(shù)壽命,理論上可以有一個(gè)規(guī)定,達(dá)到進(jìn)樣多少針,就強(qiáng)制報(bào)廢。不過好像并沒有這樣的規(guī)定,那么也可以作為一個(gè)參考,當(dāng)色譜柱的柱性能參數(shù)(就是常說的理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子等等)不達(dá)標(biāo)時(shí),參照進(jìn)樣針數(shù)判斷是柱子壽命到了,屬于不可逆因素,只能換柱子。還是其它原因,如流動(dòng)相配制錯(cuò)誤,或者流動(dòng)相變質(zhì)了,也可能稀釋液強(qiáng)度太大,也可能是方法就是錯(cuò)的,也可能是樣品本身問題。
 
  不過色譜柱的累積性損壞自然不是一朝一夕的事,柱性能是緩慢下降的,但是沒有一個(gè)特定的標(biāo)準(zhǔn),要看具體的分析方法,而且跟柱型號(hào)也有關(guān)系。常規(guī)的分析方法下C18柱壽命是很長(zhǎng)的,因?yàn)镃18柱是目前技術(shù)zui先進(jìn),質(zhì)量可靠,使用zui廣泛的色譜柱,在常規(guī)分析方法下,基本上不會(huì)損壞。但是如果流動(dòng)相比較特殊,如高鹽、高pH>8、低pH<1、高柱溫、高比例水相、高比例有機(jī)相等等,色譜柱的損壞就會(huì)相應(yīng)地加劇。
 
  這些可以算作是化學(xué)損傷,如果是操作不當(dāng),例如,流動(dòng)相和樣品溶液沒有過濾,或者撞擊色譜柱等,也會(huì)造成物理損傷,也會(huì)嚴(yán)重影響色譜柱壽命,甚至是“一招斃命”。
 
  前面提到了柱型號(hào),不同型號(hào)的色譜柱壽命當(dāng)然也不一樣,跟前面說到的C18類似的,CN柱、苯基柱等鍵合硅膠柱都具有較長(zhǎng)的使用壽命。不過所有基于硅膠基質(zhì)的色譜柱都有一個(gè)天生的弱點(diǎn),就是硅膠是能被水溶解的,雖然溶解度很小,但是長(zhǎng)年累月使用,尤其在反相色譜系統(tǒng)中,累加了高鹽、高pH、高柱溫、高比例水相等方法參數(shù)后,硅膠的流失尤為明顯。我做過一個(gè)項(xiàng)目,流動(dòng)相含鹽,柱溫高達(dá)50度,基本上一根色譜柱半年就報(bào)廢了。不過,是有一種方法可以解決這個(gè)問題的,就是在色譜柱前加一個(gè)柱芯與色譜柱類型相同的預(yù)柱,也叫保護(hù)柱,當(dāng)流動(dòng)相里溶解預(yù)柱里的硅膠飽和以后,就不再侵蝕色譜柱的硅膠,從而大大延長(zhǎng)色譜柱壽命。不過不到萬不得已還是不要使用特別苛刻的流動(dòng)相,要知道預(yù)柱的柱芯也是很貴的,那就是一根較短的色譜柱啊,就算保住了色譜柱,經(jīng)常換柱芯也是吃不消的。
 
  但是有一些類型的色譜柱,天生就是短命鬼,例如NH2柱,有時(shí)候好不容易平衡好系統(tǒng),進(jìn)個(gè)幾十針樣就OVER了,像是一次性的。就像焰火,它華麗的現(xiàn)身,轉(zhuǎn)瞬就湮滅了。這些就留待色譜柱專家們?nèi)ラ_發(fā)更加穩(wěn)定可靠的新填料了。
 
  還有一類柱子,就是手性分離柱,這在醫(yī)藥行業(yè)是很大的一個(gè)應(yīng)用。通常手性色譜柱是正相柱,這就要求我們?cè)谑褂檬中灾耙劝严到y(tǒng)置換干凈,再接上柱子用流動(dòng)相沖洗平衡進(jìn)樣。通常是甲醇、異丙醇、正已烷+異丙醇、流動(dòng)相這樣的順序,如果忘記這個(gè)過程,會(huì)造成很大的麻煩。而且有一些手性柱是涂敷柱,例如淀粉、纖維素等大分子涂敷柱非常怕水,如果系統(tǒng)中原來的反相流動(dòng)相沒有置換干凈,就會(huì)對(duì)色譜柱造成不可逆損傷,甚至報(bào)廢。近年來,科學(xué)家也開發(fā)出了鍵合的手性柱,相比較要穩(wěn)定的多,甚至也可以應(yīng)用反相色譜系統(tǒng)。
 
  使用后對(duì)色譜柱的沖洗保存也比較重要,使用了緩沖系統(tǒng)的尤其要注意。這里推薦一個(gè)反相色譜系統(tǒng)的通用沖洗流程:將所有通道置換成含有較低有機(jī)相比例的水相中,比如10-30%乙腈或甲醇,然后沖洗1個(gè)小時(shí),然后再梯度增加有機(jī)相比例,各沖洗一定時(shí)間,終保留在高有機(jī)相比例的沖洗液里。低有機(jī)相比例的沖洗液是為了盡可能地沖洗緩沖鹽。通常低壓梯度洗脫的液相色譜儀采用的是四元泵,就是單泵四通道,比例閥混合。這種混合方式有個(gè)弊端,就是混合效果差,因?yàn)楦魍ǖ啦煌壤峭ㄟ^開關(guān)各通道閥的時(shí)間來控制的。打比方乙腈:緩沖鹽=50:50,如果流速是1.0mL/min,并不是說乙腈和緩沖鹽以各0.5mL/min的流速來混合;而是流速一直是1.0mL/min,但是在往復(fù)泵一個(gè)來回的時(shí)間內(nèi),兩個(gè)通道分別打開一半的時(shí)間,也就是說系統(tǒng)管道里是一段乙腈、一段緩沖鹽。這樣就會(huì)造成鹽的析出。所以,往往是兩通道混合,就算沒有用緩沖鹽,還是建議先按比例混合好了,然后走單通道,否則的話一樣會(huì)造成鹽析出,或者基線波動(dòng)。走梯度洗脫的話,往往會(huì)把有機(jī)相通道(B)中加入一定比例的水,或者把水相通道(A)配成梯度洗脫的初始比例,把有機(jī)相通道(B)配成梯度洗脫終的比例。
 
  這里有兩點(diǎn)需要說明,一,一般認(rèn)為,色譜系統(tǒng)包括色譜柱的沖洗甚至保存,都可以使用流動(dòng)相,只是不加緩沖鹽、酸堿等。例如上面提到的乙腈:緩沖鹽=50:50,做完樣品以后,就可以用50%乙腈/水來沖洗保存。有一些品牌色譜柱,例如資生堂,建議如果不是含鹽或者強(qiáng)酸強(qiáng)堿,一般不建議沖洗。不過這只適合短期保存,也就是沒隔多久又要再次使用。長(zhǎng)期不用的色譜系統(tǒng)包括色譜柱還是應(yīng)該沖洗后保存在高比例低極性溶劑體系中。一般建議正相系統(tǒng)保存在正已烷:異丙醇=90:10,反相系統(tǒng)保存在乙腈:水=90:10或者100%乙腈中。第二,隨著快速分離色譜柱的發(fā)展,很多的低粒徑色譜柱得到應(yīng)用,而且往往柱溫也較高,通常達(dá)到50度或以上,這種色譜系統(tǒng)通常柱壓也較高,貿(mào)然用高比例水相沖洗可能會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)超壓。可以先用流動(dòng)相沖洗,或者斷開色譜柱,用高比例水相沖洗系統(tǒng),再接上柱子逐步提高有機(jī)相比例沖洗,也可以先調(diào)低流速?zèng)_洗。而且,待沖洗快要結(jié)束時(shí)再降低柱溫。
 
  下面說說氣相色譜柱,現(xiàn)如今填充柱幾乎退出了歷史,人們說起氣相色譜柱自然就是石英毛細(xì)管柱。
 
  相比較液相色譜柱,感覺氣相柱要簡(jiǎn)單的多,而且,往往氣相柱各型號(hào)之間的專屬也不那么強(qiáng),往往一個(gè)樣品用多種色譜柱分析,通過調(diào)整溫度程序,也可以得到相類似的分析結(jié)果。結(jié)合到本文標(biāo)題,氣相色譜柱的進(jìn)樣針數(shù)同樣也僅供參考,不能作為色譜柱壽命的唯①參數(shù),影響氣相色譜柱的壽命的因素基本為高溫、高溫時(shí)間、樣品中的高沸物(包括一些在不適合的方法中,樣品的分解或聚合物)、載氣純度等。
 
  常規(guī)的氣相色譜柱通常是石英管表面涂敷的液體填料,所以一般情況下,氣相色譜的分離其實(shí)是氣化后的樣品在液體填料里的溶解再揮發(fā)的性質(zhì)不同來實(shí)現(xiàn)的。那么既然填料是液體,自然就會(huì)揮發(fā)了,氣相色譜柱的壽命zui大的影響因素就在這里。氣相色譜柱都會(huì)有一個(gè)極限溫度,一般使用溫度會(huì)在這個(gè)極限溫度下的20度左右。通常氣相分析方法是程序升溫的,高溫的溫度和保留時(shí)間決定了每一次進(jìn)樣對(duì)色譜柱的影響。不過不同類型的色譜柱因?yàn)槠涮盍系男再|(zhì)不同,其極限溫度也不同,自然zui高使用溫度就不同。反過來說,在相同使用溫度下,其壽命也不相同。
 
  不管什么分析方法都要盡可能的真實(shí)反應(yīng)樣品里的溶劑及所有物質(zhì)的含量, 氣相色譜分析樣品的首要條件是,樣品要能被氣化,就是進(jìn)樣口溫度及程序終溫要大于樣品的沸點(diǎn)(這也不是jue對(duì)的),當(dāng)樣品中有高沸點(diǎn)的物質(zhì),甚至是無機(jī)鹽、機(jī)械雜質(zhì),不能被氣化留在了襯管里,甚至留在了色譜柱中,就會(huì)對(duì)色譜柱有損傷。這種情況是要處理一下樣品,萃取、蒸餾、過濾都是常用的方法。如果實(shí)在無法避免,就要經(jīng)常更換隔墊、襯管玻璃毛等,過一定時(shí)間還要把色譜柱前段割一段下來,通常是1米左右。除了這些,還應(yīng)注意對(duì)樣品性質(zhì)的了解,如果樣品的熱穩(wěn)定性差,進(jìn)樣分析過程中發(fā)生了分解或者聚合,產(chǎn)生高沸物就會(huì)對(duì)色譜柱產(chǎn)生很大影響,如果這些物質(zhì)不能被溶劑沖洗的話,這種損傷就是不可逆的,而且分析結(jié)果也不準(zhǔn)確。這種情況下就要適當(dāng)?shù)慕档蜏囟?,直到不發(fā)生這種反應(yīng)。或者換其它的分析方法。
 
  通常我們使用的 載氣是高純氮?dú)猓蚓蛢蓚€(gè)字——便宜!但是,排除經(jīng)濟(jì)因素,這并不是一個(gè)zui佳的選擇。因?yàn)榈獨(dú)獾纳a(chǎn)就是液態(tài)空氣蒸發(fā)來的,但是因?yàn)榈獨(dú)夂脱鯕庑再|(zhì)接近,一般很難杜絕高純氮?dú)饫锖猩倭康难鯕?。氧氣在高溫柱?duì)整個(gè)氣相色譜系統(tǒng)包括色譜柱都會(huì)產(chǎn)生不良影響。所以一般儀器廠家還是建議使用高純氦,尤其在進(jìn)行計(jì)量、驗(yàn)證等高標(biāo)準(zhǔn)分析時(shí),不過一瓶高純氦可以換5瓶高純氮,一般用戶還是選擇使用高純氮?dú)?。其?shí)從儀器性能來講,也可以使用高純氫氣作為載氣,低含氧量、低背景、低廉的價(jià)格都是不錯(cuò)的選擇,當(dāng)然一般考慮到氫氣的泄漏以及儲(chǔ)運(yùn)的風(fēng)險(xiǎn),往往被用戶所排除。不過,帶TCD檢測(cè)器的氣相色譜往往還是使用高純氫氣作為載氣。
 
  說了這么多,zui后感性的總結(jié)一下。真正做儀器分析人,都能發(fā)現(xiàn)不同品牌的儀器,甚至每一臺(tái)儀器的不同,只有你真正熱愛儀器分析,把每一臺(tái)儀器當(dāng)成好
 
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  1.柱物理損壞
 
  色譜柱有物理損壞是造成峰形拖尾的根源。的解決方法就是更換新柱。
 
  2.柱內(nèi)填料污染
 
  流動(dòng)相和樣品中的雜質(zhì)是色譜柱主要污染源。
 
  流動(dòng)相所用的各種溶劑至少是分析純,盡量使用色譜純?cè)噭A鲃?dòng)相所用的水要是超純水或全玻璃器皿雙蒸水。用前先用0.45um溶劑微孔過濾(器)過濾,除去可能存在的微粒。流動(dòng)相建議現(xiàn)用現(xiàn)配,對(duì)于含鹽的溶液尤其注意長(zhǎng)置會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌或出現(xiàn)沉淀。此外還得保證儲(chǔ)存流動(dòng)相的容器清潔。
 
  復(fù)雜樣品可選用0.45um溶劑微孔過濾(器)或樣品預(yù)處理柱對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,確保樣品中不含微粒雜質(zhì)。若樣品不便處理,要使用保護(hù)柱。柱內(nèi)填料污染時(shí),可將柱頭螺絲卸下,用專用工具挖出柱內(nèi)前段被污染填料,再以相同的填料重新填入,修復(fù)。或以能溶解污染物的流動(dòng)相按色譜柱使用的相反方向,沖洗色譜柱(約20至30倍柱體積,或視具體情況而定;另外,此時(shí)不能接檢測(cè)器),將污染物沖出色譜柱,再按色譜柱標(biāo)明的使用方向使用。
 
  3.柱進(jìn)口處有異物
 
  當(dāng)斷定是柱進(jìn)口處有異物時(shí),可將柱頭螺絲卸下,取出濾帽并將其置于20%硝酸溶液中,用超聲波清洗約20分鐘,再置于超純水中,并用超聲波清洗約10分鐘,重新裝入色譜柱內(nèi)即可。
 
  4.樣品濃度過高致使柱超載
 
  樣品在柱上超載能引起峰展寬,拖尾(或伸舌)。
 
  適當(dāng)減小進(jìn)樣量或樣品濃度(需要時(shí),可提高檢測(cè)器靈敏度)直至峰形和保留時(shí)間不再改變,便可消除這種不良影響。減小進(jìn)樣量還能改善其分離度。正常情況下,樣品中每種化合物在150×4.6mm柱中進(jìn)樣量保持在3~50ug范圍內(nèi),不會(huì)引起明顯超載。
 
  5.樣品溶劑不對(duì)
 
  選擇合適的樣品溶劑,以排除不必要的干擾。要選用流動(dòng)相溶解樣品。
 
  6.柱外效應(yīng)
 
  柱外效應(yīng)(即進(jìn)樣閥、色譜柱及檢測(cè)器間的管路過長(zhǎng)、直徑過粗、管路接頭不匹配、有死體積)是影響色譜柱柱效的主要因素之一。所以在可能的條件下,色譜柱的兩端連接管路要盡可能短,連接管內(nèi)徑盡可能細(xì)小,切口務(wù)必平整光滑,盡可能的減小死體積,以防止因樣品擴(kuò)散造成不能反映色譜柱真實(shí)柱效等情況發(fā)生。
 
  7.緩沖不足或不合適
 
  在緩沖不好或離子強(qiáng)度過低的分離中,也會(huì)出現(xiàn)保留時(shí)間重現(xiàn)性差和峰形拖尾。增加緩沖濃度(與樣品大小相匹配)能改善此情況。
 
  8.硅醇基團(tuán)作用
 
  仔細(xì)分析色譜柱內(nèi)填料表面性質(zhì)可知:反相色譜柱填料的表面大約被鍵合相覆蓋了一半,其余的就是未被鍵合的硅醇基團(tuán)。所謂的保留是指樣品分子與鍵合相相互作用的結(jié)果。但是,酸性或堿性化合物與硅膠表面殘存的硅醇基團(tuán)或金屬雜質(zhì)之間相互作用而引起雙重保留機(jī)理,因此,發(fā)生了峰形拖尾。
 
  為了減小峰形拖尾,通??稍诹鲃?dòng)相加入25mM三乙胺(抑制劑)。三乙胺能與硅醇基團(tuán)發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用,從而降低或阻斷樣品分子與硅醇基團(tuán)的作用,以保證保留機(jī)理正常進(jìn)行,并大大緩解了峰形拖尾。使用長(zhǎng)鏈的硅醇基抑制劑,雖起效較慢,但持續(xù)力較三乙胺長(zhǎng)。因?yàn)橐种苿┓肿又谐税坊c硅醇基團(tuán)發(fā)生極性作用外,大分子中非極性部分與固定相也會(huì)發(fā)生反相作用而產(chǎn)生保留現(xiàn)象。如果將抑制劑加至樣品中,效果會(huì)顯著。
 
  9.柱內(nèi)金屬污染
 
  柱內(nèi)金屬污染(Fe,Ni等)可引起某引些化合物峰形拖尾。金屬可由填料本身帶進(jìn),也可由腐蝕性流動(dòng)相緩慢溶解柱進(jìn)口的金屬濾片,隨流動(dòng)相沉積到柱填料中。例如C18柱填料被金屬污染后,造成酸性/堿性樣品拖尾,可用堿洗/酸洗后再鍵合的填料,得到的峰是尖銳且對(duì)稱的。
 



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