①樣品體積過(guò)大--用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第—峰的15%
②樣品溶劑過(guò)強(qiáng)--采用較弱的樣品溶劑
③柱塌陷或形成短路通道--更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件
④柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效--更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過(guò)濾器,過(guò)濾樣品
⑤進(jìn)樣器損壞--更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子
高效液相色譜儀分析中,選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)考慮流動(dòng)相與填料的作用、純度、與檢測(cè)器的匹配、粘度、對(duì)樣品的溶解度和樣品回收等方面。
1、流動(dòng)相與填料的作用:
流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。
低交聯(lián)度的離子交換樹(shù)脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮,從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。
堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。
酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁和氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。
2、純度:
色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過(guò)有關(guān),特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。
3、與檢測(cè)器的匹配:
當(dāng)使用UVD時(shí),所用流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)沒(méi)有吸收或吸收很小。
當(dāng)使用RID時(shí),應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑作流動(dòng)相,以提高靈敏度。
4、粘度:
高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散和傳質(zhì),使柱效降低,還會(huì)使柱壓增加,分離時(shí)間延長(zhǎng)。盡量選擇沸點(diǎn)在100℃以下的流動(dòng)相。
5、對(duì)樣品的溶解度:如果溶解度欠佳,樣品會(huì)在色譜柱內(nèi)沉淀,不但影響純化分離,而且會(huì)使色譜柱惡化。
6、樣品回收:應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑。
高效液相色譜儀分析選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題:
1.盡量使用高純度溶劑作流動(dòng)相,防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn),產(chǎn)生偽峰。
2.避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降和損壞色譜柱,如使固定液溶解流失和酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。
3.樣品在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度,防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。
4.流動(dòng)相粘度低(粘度適中)。若使用高粘度溶劑,會(huì)增高壓力,不利于分離。常用低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等。但粘度過(guò)低的溶劑也不宜采用,如戊烷等,它們?nèi)菀自谏V柱和檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡,影響分離。
5.化學(xué)穩(wěn)定性好。
6.流動(dòng)相應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。
對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器,應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止波長(zhǎng)長(zhǎng)。所謂溶劑的紫外截止波長(zhǎng)是指當(dāng)小于截止波長(zhǎng)的輻射通過(guò)溶劑時(shí),溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收,此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的,會(huì)嚴(yán)重干擾組分的吸收測(cè)量。
對(duì)于示差折光檢測(cè)器,要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相,以達(dá)到zui高靈敏度。
液相色譜儀,看你分離的樣品的種類,看流動(dòng)相是否和樣品互溶,分離程度,一般加水多少,甲醇,乙腈很多種,看樣品的沸點(diǎn),溶解性。
色譜柱在使用前,可以進(jìn)行柱的性能測(cè)試,并將結(jié)果保存起來(lái),作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外,在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是較佳條件),只有這樣,測(cè)得的結(jié)果才有可比性。
1、樣品的前處理:
a、可以使用流動(dòng)相溶解樣品。
b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。使用0.45?m的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動(dòng)相的配制:
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn):
a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力,保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。
b、流動(dòng)相具有一定惰性,與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。
c、流動(dòng)相的黏度要盡量小,以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果;同時(shí)降低柱壓降,延長(zhǎng)液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。
d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器,可以使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低,否則容易產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。
f、在流動(dòng)相配制好后,一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè),還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動(dòng)相流速的選擇:
因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù),使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱,要追求較佳柱效,可以使用較佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,流速一般選擇1ml/min,對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱,流速0.8ml/min為佳。
當(dāng)選用較佳流速時(shí),分析時(shí)間可能延長(zhǎng)。可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí),可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。