疏水色譜柱是利用樣品分子與固定相的疏水力作用的不同，用流動(dòng)相洗脫時(shí)，各組分遷移速度不同而達(dá)到分離的目的。流動(dòng)相一般為pH 6-8的鹽水溶液，具有對(duì)蛋白質(zhì)的回收率高，蛋白質(zhì)變性可能性小等優(yōu)勢(shì)。由于流動(dòng)相中不使用有機(jī)溶劑，也有利于蛋白質(zhì)保持固有的活性，其中影響疏水色譜柱實(shí)驗(yàn)效果的影響因素主要有以下四個(gè)?
1、鹽類(lèi)和鹽組成
鹽的摩爾表面張力增大，蛋白質(zhì)在疏水層析柱內(nèi)的吸附能力相應(yīng)增大。各種鹽離子和離子對(duì)具有破壞周?chē)肿佑行蚺帕械哪芰Α?流動(dòng)相中鹽的組成對(duì)蛋白質(zhì)在疏水層析介質(zhì)上的吸附能力具有為重大的影響。選擇合適的鹽對(duì)保證蛋白質(zhì)的分離以及分離后蛋白質(zhì)的活性都很重要。硫酸銨、醋酸銨、氯化鈉和磷酸鹽是疏水層析分離常用的幾種鹽。
2、離子強(qiáng)度
離子強(qiáng)度的大小直接影響樣品組分在固定相的保留值。一般增加離子強(qiáng)度來(lái)增加組分的保留值，降低離子強(qiáng)度來(lái)提高組分的解析附能力。
HIC實(shí)驗(yàn)中，改變離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫的方式，一般宜采用梯度洗脫法，可提高分離的選擇性。
3、溶液的酸堿度
溶液的pH值主要考慮能維持生物大分子生物活性的pH環(huán)境。一般情況，溶液的pH接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，其疏水性增加，有利于與固定相配基相互作用;遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)，其疏水性減少，不利于與固定相配基結(jié)合，但有利于蛋白質(zhì)洗脫。因此通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H也可以改變蛋白質(zhì)的疏水性。
4、柱溫
一般柱溫升高，生物大分子的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高層析柱的分離度，所以有時(shí)可以通過(guò)提高柱溫來(lái)增加疏水基團(tuán)與配基間的相互作用，分離性質(zhì)相近的化合物，如對(duì)分離一些小分子是非常有效的。但是對(duì)于具有生物活性的物質(zhì)或酶類(lèi)，在高溫條件下易變性失活，因此不宜在高溫條件下進(jìn)行分離。一般都在常溫或低溫下操作。
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