液相色譜柱的使用維護(hù)
一、液相色譜柱的基本結(jié)構(gòu)。
液相色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲（封頭）與柱填料等組成。
柱管：多用不銹鋼制成，若果使用時(shí)柱壓不高于70 kg/cm2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。用于柱填料的裝填。
壓帽：即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽，中部有小孔，多為聚四氟乙烯制成，用于固定篩板。
密封環(huán)：位于接頭螺旋環(huán)內(nèi)壁的彈性環(huán)，多為聚四氟乙烯制成，用于色譜柱兩端壓帽與柱外壁的密封。
二、色譜柱使用前注意事項(xiàng)。
色譜柱在使用前，hao進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。在做柱性能測(cè)試時(shí)要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是jia條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同。
1、樣品的前處理
a、hao使用流動(dòng)相溶解樣品。
b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
c、使用0.45μm或0.22µm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動(dòng)相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：
a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。
b、流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)
c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長(zhǎng)泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。
d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，hao使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。
f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動(dòng)相流速的選擇
因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求jia柱效，hao使用jia流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。
當(dāng)選用jia流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a．含水流動(dòng)相hao在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。hao加入die氮化鈉，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。
b．流動(dòng)相要求使用0.45 μm或0.22µm濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。
c．使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
三、 色譜柱的使用及維護(hù)
1、C18等反相色譜柱使用維護(hù)
色譜柱每次使用時(shí)一定不要直接使用含無(wú)機(jī)鹽的流動(dòng)相！
A、建議首先使用含有10～30%乙腈或甲醇的高水相（不含鹽）沖洗系統(tǒng)及色譜柱30min以上（如用水-有機(jī)相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速?zèng)_洗30min以上），再更換為分析流動(dòng)相。
B、如果流動(dòng)相中含有緩沖鹽，請(qǐng)使用過(guò)渡流動(dòng)相過(guò)渡后再換分析流動(dòng)相平衡；
正確使用緩沖鹽，正確使用緩沖鹽的目的是防止緩沖鹽析出，使用緩沖鹽的方法可歸結(jié)為一句話：使用前要過(guò)渡，使用后要沖洗。具體方法如下：
注意：過(guò)渡流動(dòng)相是指有機(jī)相和水相比例與分析流動(dòng)相相同比例，只是不含有緩
沖鹽；
阿奇霉素新柱：建議在正常平衡后增加0.1%磷酸/甲醇（90/10）沖洗17小時(shí)
C、注意事項(xiàng)。
C.1除 AQ外（可耐100%純水），其它反相柱應(yīng)避免使用純水相，有機(jī)相比例建議在5%以上。即使AQ也應(yīng)避免長(zhǎng)時(shí)間使用100%水沖洗。如果一定要用100%水作為流動(dòng)相，請(qǐng)?jiān)谒嵝詶l件下使用磷酸鹽緩沖液，這樣能延長(zhǎng)色譜柱壽命。
C.2請(qǐng)注意色譜柱的pH、壓力耐受范圍，如超出范圍或變化幅度較大會(huì)引起重現(xiàn)性變差、色譜柱提前劣化等問(wèn)題。
C.3在有機(jī)溶劑含量少、色譜柱溫度高的條件下，耐酸耐堿性能會(huì)降低。
C.4使用含有離子對(duì)試劑等表面活性劑的流動(dòng)相，色譜柱的壽命會(huì)變短。
C.5請(qǐng)使用與分析柱相同填料的預(yù)柱，否則可能無(wú)法得到正常的色譜峰。
C.6.在使用了TFA等強(qiáng)有機(jī)酸或堿(pH>8)的流動(dòng)相之后，請(qǐng)使用與所選用的流動(dòng)相組成相同的有機(jī)溶劑和水的混合溶液進(jìn)行置換。若是一周以上的長(zhǎng)期保存，請(qǐng)進(jìn)一步使用乙腈進(jìn)行置換，并用附帶的堵頭密封，保存在冷暗處。
C.7通常的沖洗可使用高水相-高有機(jī)相-有機(jī)相（乙腈或甲醇）依次沖洗。在甲醇、乙腈沖洗過(guò)程中，重復(fù)注入100～200μl四qi呋喃或異丙醇可有助于去除強(qiáng)疏水性物質(zhì)。
C.8當(dāng)供試品溶液中含有一定量表面活性劑，多次進(jìn)樣后，由于表面活性劑會(huì)在篩板及硅膠表面形成表面膜，導(dǎo)致峰變寬、拖尾甚至分叉。此時(shí)，處理方法如下：將色譜柱反向連接接(詢(xún)問(wèn)廠家)，不接檢測(cè)器，用水-乙腈（90：10～95:5），以0.6ml/min流速?zèng)_洗2h以上→再用100%乙腈，以0.6ml/min流速?zèng)_洗1h以上→然后正向連接好色譜柱，用水-乙腈（90：10～95:5），以1ml/min流速?zèng)_洗1h以上→再用100%乙腈，以1ml/min流速?zèng)_洗1h以上
2、SCX 氫型陽(yáng)離子交換柱。
A、每次使用時(shí)請(qǐng)一定避免直接使用含無(wú)機(jī)鹽的流動(dòng)相，避免鹽析。可使用高水相過(guò)渡后再使用分析流動(dòng)相。（葡jia胺樣品新柱子，用60%乙腈/40水過(guò)渡半小時(shí)（正常流速即可），后再直接用葡jia胺流動(dòng)相平衡即可0.2ml流速平衡過(guò)液，沖洗也一樣先用60%乙腈40水，低流速?zèng)_半小時(shí)，后轉(zhuǎn)到100乙腈）
B、離子交換柱的平衡時(shí)間較反相柱更長(zhǎng)，請(qǐng)?jiān)诜治銮氨ＷC充分的平衡。
C、.離子交換模式中，洗脫行為一般隨以下幾點(diǎn)發(fā)生大幅變化：
①pH ②鹽濃度 ③有機(jī)溶劑量 ④鹽種類(lèi)
*為了使樣品充分離子化，流動(dòng)相pHhao與樣品的pKa相差 2.0以上
D、短期保存時(shí)，請(qǐng)使用含鹽的水系流動(dòng)相來(lái)保存；長(zhǎng)期保存時(shí)，請(qǐng)用出廠（或咨詢(xún)廠家）流動(dòng)相純乙腈來(lái)保存。注意擰緊柱兩端自帶堵頭，防止溶劑揮發(fā)。
3、NH2色譜柱。
A、每次使用時(shí)請(qǐng)注意避免鹽析。
B、弱陰離子交換模式中，一般隨以下幾點(diǎn)洗脫行為發(fā)生大幅變化：
①pH ②鹽濃度 ③有機(jī)溶劑量 ④鹽種類(lèi)
*為了使樣品充分離子化，流動(dòng)相pHhao與樣品的pKa相差 2.0以上
C、HILIC模式中，建議使用乙腈作為有機(jī)溶液。乙腈量增加，保留能力增大。
D、糖類(lèi)的分析
①請(qǐng)?jiān)O(shè)定乙腈/水的流動(dòng)相條件。乙腈的濃度越高，則對(duì)糖的保留能力越強(qiáng)。
②若采用含甲醇或緩沖鹽的流動(dòng)相，峰會(huì)展寬。
③將其他公司硅膠類(lèi)NH2色譜柱流動(dòng)相條件中的乙腈含量增加5vol%，使用我公司NH2柱可重現(xiàn)幾乎相同的色譜圖。
④若將糖的水溶液作為樣品注入，譜峰會(huì)展寬。請(qǐng)使用含乙腈50%以上的溶劑來(lái)配制糖類(lèi)樣品。
⑤曾在酸性條件下使用過(guò)的色譜柱，糖類(lèi)分析的保留時(shí)間、峰形會(huì)發(fā)生變化。
E、離子型物質(zhì)的分析
①請(qǐng)?jiān)O(shè)定乙腈/磷酸緩沖液且具有一定pH值的流動(dòng)相條件。
②考察流動(dòng)相條件時(shí)，按照pH由高到低的順序進(jìn)行考察。如果曾經(jīng)在低pH下使用，填料的表面將無(wú)法回到初始狀態(tài)。
③有時(shí)需要長(zhǎng)時(shí)間平衡色譜柱(24小時(shí)以上)。平衡所需時(shí)間與通液量和鹽濃度緊密相關(guān)，因此，時(shí)間緊急時(shí)請(qǐng)?zhí)岣吡魉伲騪H不變而增加流動(dòng)相的鹽濃度來(lái)進(jìn)行平衡。
④抗壞血酸的色譜峰有時(shí)會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象(樣品氧化)。
F、尿囊素的分析
尿囊素在pH 2～8范圍內(nèi)未離子化，請(qǐng)使用磷酸緩沖液作為流動(dòng)相進(jìn)行分析。
流動(dòng)相例：25 mmol/L KH2PO4/ CH3CN = 20 / 80，pH=1.5(H3PO4)
G.一個(gè)月以?xún)?nèi)的保存，請(qǐng)使用與所選用流動(dòng)相組成相同的有機(jī)溶劑和水的混合溶液（不含酸、無(wú)機(jī)鹽）進(jìn)行置換，請(qǐng)避免只用水進(jìn)行置換；一個(gè)月以上的長(zhǎng)期保存，在進(jìn)行了上述處理之后，請(qǐng)用出廠時(shí)的溶劑（乙腈）置換并保存
四、 色譜柱的再生
色譜柱經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的使用，會(huì)出現(xiàn)柱壓升高，柱效下降，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)， 使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能是柱頭塌陷，死體積增大。您也可嘗試用下面列舉色譜柱再生的方法處理色譜柱。
A、反相色譜柱的再生：
用以下溶劑至少各30mL沖洗色譜柱(分析柱)
100%甲醇→100%乙腈→75%乙腈+25%異丙醇→100%異丙醇→100%二氯甲烷→100%己烷→100%異丙醇→75%乙腈+25% 異丙醇→100%乙腈
*若使用己烷或二氯甲烷沖洗色譜柱, 則在重新使用反相流動(dòng)相以前, 必須用異丙醇沖洗色譜柱!!!
一般情況下 ,極性固定相(如 Si , N H2 , Diol 基色譜填料) 的再生可以依次使用 20～30 倍色譜柱體積的正已烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇沖洗色譜柱(因異丙醇的粘度較大 ,沖洗過(guò)程中隨時(shí)注意調(diào)整沖洗流速) ,然后再以相反的溶劑順序沖洗色譜柱。
當(dāng)樣品定量管經(jīng)過(guò)充分的沖洗后，可以將旋柄轉(zhuǎn)回取樣位置(Load)，也可以繼續(xù)保持在進(jìn)樣位置，到下次取樣前才切換回取樣位置。在切換回取樣位置時(shí)，將樣品進(jìn)樣針或微量樣品進(jìn)樣針從進(jìn)樣閥中拔出。
為防止交叉污染，正常情況下不必每次進(jìn)樣后都沖洗進(jìn)樣閥注射針導(dǎo)入口。進(jìn)樣閥內(nèi)根據(jù)專(zhuān)利設(shè)計(jì)的直接連接進(jìn)樣孔，可以使注射針頭的前端直接連接到樣品定量管的末端，沒(méi)有其他空間供樣品殘留。這樣在下一次進(jìn)樣時(shí)，就不會(huì)有上一次殘留的樣品進(jìn)入樣品定量管。
但是在進(jìn)樣針頭插入或拔出過(guò)程中，會(huì)有痕量的樣品沉積在針頭密封區(qū)域。精密的測(cè)定顯示這種殘留有1nL ~ 10nL。這表明進(jìn)20μL樣品，會(huì)殘留0.005% ~ 0.05%。每次進(jìn)樣后沖洗注射針導(dǎo)入口可以將此殘留沖洗干凈。沖洗注射針導(dǎo)入口的過(guò)程為：設(shè)定流動(dòng)相的流速為0.1mL/min ~ 1mL/min，將注射針導(dǎo)入口沖洗頭(Rheodyne部件號(hào)7125-054)連接到一只體積相對(duì)較大的注射器上，用大量的流動(dòng)相只在進(jìn)樣位置清洗注射針導(dǎo)入口。這樣進(jìn)入進(jìn)樣閥中的液體繞過(guò)樣品定量管由樣品溢出管5# 口排出。這一過(guò)程可以將注射針導(dǎo)入口、引導(dǎo)管、注射針導(dǎo)入管和注射針密封圈徹底清洗。而采用注射器完全插入式的沖洗方式，則不能全部清洗上述部分的表面。在取樣位置將注射針插入注射針導(dǎo)入口時(shí)，針頭推動(dòng)注射針密封圈內(nèi)少量樣品液體(上一次沖洗注射針導(dǎo)入管留下的)進(jìn)入樣品定量管。當(dāng)該樣品液體與所用的流動(dòng)相組成不同，且同時(shí)采用部分充滿(mǎn)定量管進(jìn)樣方式時(shí)，在高靈敏度的檢測(cè)器上可能出現(xiàn)怪峰。所以沖洗注射針時(shí)可以用流動(dòng)相沖洗。
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