紫外可見分光光度計操作規(guī)程
目的：建立紫外可見分光光度計操作規(guī)程，確保其使用安全、正確。范圍：適用于752型紫外可見分光光度計。操作規(guī)程：
1. 打開儀器開關，儀器使用前應預熱30分鐘。
2. 轉(zhuǎn)動波長旋鈕，觀察波長顯示窗，調(diào)整至需要的測量波長。
3. 根據(jù)測量波長，撥動光源切換桿，手動切換光源。200-339nm使用氘燈，切換桿撥至紫外區(qū)；340nm-1000nm使用鹵鎢燈，切換桿撥至可見區(qū)。
4. 調(diào)T零在透視比（T）模式，將遮光體放入樣品架，合上樣品室蓋，拉動樣品架拉桿使其進入光路。按下“調(diào)0%”鍵，屏幕上顯示“000.0”或“-000.0”時，調(diào)T零完成。
5. 調(diào)100%T/ OA
先用參比（空白）溶液蕩洗比色皿2-3次，將參比（空白）溶液倒入比色皿，溶液量約為比色皿高度的3/4，用擦鏡紙將透光面擦拭干凈，按一定的方向，將比色皿放入樣品架。合上樣品室蓋，拉動樣品架拉桿使其進入光路。按下“調(diào)100%”鍵，屏幕上顯示“BL”延時數(shù)秒便出現(xiàn)“100.0”（T模式）或“000.0”、“-000.0”（A模式）。調(diào)100%T/ OA完成。
6. 測量吸光度
6.1 參照操作步驟3、步驟4。
6.2 在吸光度（A）模式，參照步驟5調(diào)100%T/ OA。
6.3 用待測溶液蕩洗比色皿2-3次，將待測溶液倒入比色皿，溶液量約為比色皿
高度的3/4，用擦鏡紙將透光面擦拭干凈，按一定的方向，將比色皿放入樣品架。合上樣品室蓋，拉動樣品架拉桿使其進入光路，讀取測量數(shù)據(jù)。7. 測量透視比
7.1 參照操作步驟3、步驟4。
文庫
7.2 在透視比（T）模式，參照步驟5調(diào)100%T/ OA。
7.3 用待測溶液蕩洗比色皿2-3次，將待測溶液倒入比色皿，溶液量約為比色皿
高度的3/4，用擦鏡紙將透光面擦拭干凈，按一定的方向，將比色皿放入樣品架。合上樣品室蓋，拉動樣品架拉桿使其進入光路，讀取測量數(shù)據(jù)。
8. 濃度測量
8.1 參照操作步驟3、步驟4。
8.2 在透視比（T）模式，參照步驟5調(diào)100%T/ OA。
8.3 用標準濃度溶液蕩洗比色皿2-3次，將標準濃度溶液倒入比色皿，溶液量約
為比色皿高度的3/4，用擦鏡紙將透光面擦拭干凈，按一定的方向，將比色皿放入樣品架。合上樣品室蓋，拉動樣品架拉桿使其進入光路。 8.4 按下“功能鍵”切換至濃度（C）模式。
8.5 按下“▲”或“▼”鍵，設置標準溶液濃度，并按下“確認”鍵。
8.6 用待測溶液蕩洗比色皿2-3次，將待測溶液倒入比色皿，溶液量約為比色皿
高度的3/4，用擦鏡紙將透光面擦拭干凈，按一定的方向，將比色皿放入樣品架。合上樣品室蓋，拉動樣品架拉桿使其進入光路，讀取測量數(shù)據(jù)。
9. 斜率測量
9.1 參照操作步驟3、步驟4。
9.2 在透視比（T）模式，參照步驟5調(diào)100%T/ OA。
9.3 按下“功能鍵”切換至斜率（F）模式。
9.4 按下“▲”或“▼”鍵，設置樣品斜率。
9.5 用待測溶液蕩洗比色皿2-3次，將待測溶液倒入比色皿，溶液量約為比色皿
高度的3/4，用擦鏡紙將透光面擦拭干凈，按一定的方向，將比色皿放入樣品架。合上樣品室蓋，拉動樣品架拉桿使其進入光路，按下“確認”鍵（此時儀器自動切換至濃度（C）模式），讀取測量數(shù)據(jù)。
10. 測量完畢
10.1 測量完畢后，清理樣品室，將比色皿清洗干凈，倒置晾干后收起。
10.2 關閉電源，蓋好防塵罩，結(jié)束試驗。
注意事項：
1、調(diào)100%T/ OA后，儀器應穩(wěn)定5分鐘再進行測量。
2、光源選擇不正確或光源切換桿不到位，將直接影響儀器的穩(wěn)定性。
3、比色皿應配對使用，不得混用。置入樣品架時，石英比色皿上端的“Q”標記（或箭頭）、玻璃比色皿上端的“G”標記方向應一致。
4、玻璃比色皿適用范圍：320nm~1100nm，石英比色皿適用范圍：200nm~1100nm。
分光光度計，又稱光譜儀(spectrometer)，是將成分復雜的光，分解為光譜線的科學儀器。測量范圍一般包括波長范圍為380~780 nm的可見光區(qū)和波長范圍為200~380 nm的紫外光區(qū)。不同的光源都有其特有的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源。鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的380~780nm波長的光譜光通過三棱鏡折射后，可得到由紅、橙、黃、綠、藍、靛、紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見光分光光度計的光源。
光度定義
分光光度法是在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進行定性或定量分析。常用的波長范圍為:(1)200~380nm的紫外光區(qū)，(2)380~780nm的可見光區(qū)，(3)2.5~25μm(按波數(shù)計為4000cm<-1>~400cm<-1>)的紅外光區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計(或比色計)、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和準確度，所有儀器應按照國家計量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定，定期進行校正檢定。
儀器組成
分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。
儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成。
原理
分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光線透過測試的樣品后，部分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比，其關系如下式:
A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc
式中 :A 為吸光度;
I。為入射的單色光強度;
I 為透射的單色光強度;
T 為物質(zhì)的透射率;
k 為摩爾吸收系數(shù);
L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長;
c 為物質(zhì)的濃度;
物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應用標準品或?qū)φ掌吠瑫r操作。
現(xiàn)今，國內(nèi)大部分的可見分光光度計，紫外可見分光光度計有所改良。隨著行業(yè)的進步，技術改良，部分廠家對于燈源更換問題的重視程度也越來越高，燈源更換也越來越方便簡捷。很多新機型甚至不需要拆下整機外殼，只要打開燈源不為的蓋子就能更換燈源。
分光光度計使用過程中的注意事項：分光光度計使用過程中，在不使用紫外光的情況下可以關閉氘燈（國內(nèi)很多機型現(xiàn)在都使用的進口氘燈，用的賀利氏的氘燈較多，一般使用壽命在2000小時，國產(chǎn)的氘燈一般壽命在1000小時左右），關閉氘燈的話可以降低氘燈的能量損耗
分光光度計更換過程中的注意事項：
1、 關閉電源
2、 拔除電源線
3、 打開蓋子到燈源部位
4、 如果是分光光度計剛使用結(jié)束，要等10分鐘后在進行更換燈源（燈源剛使用完，溫度比較高，防止燙到手）
5、 放電，將電路殘余電壓釋放掉（可以接兩根線到地表完成放電操作）
老款機型鎢燈的更換（主要講國產(chǎn)的）：
1、第一點很重要，就是帶上手套，否則會污染鎢燈，如果沒有條件的話也要把手洗干凈，防止手上的污跡污染鎢燈
2、需要量取鎢燈燈絲距離底座的立體位置（簡單的說，距離分光光度計內(nèi)三個面的位置），可以用游標卡尺量
3、部分鎢燈是可以直接拔的，還有些鎢燈需要用螺絲刀拆卸，也有需要通過扳手旋松的，簡單講述，就是拆下鎢燈，在帶手套的情況下可以直接接觸燈源，未帶手套的情況下，盡量避免接觸燈源，拿的時候可以鎢燈底座的兩個觸角
4、裝鎢燈，先把鎢燈裝上，起初不要把螺絲旋太緊，因為還需要調(diào)整位置
5、接下來，第二步做的工作就能用到了。根據(jù)第二步測量的位置調(diào)整鎢燈，上下左右移動，直到把鎢燈調(diào)整到預先測量的位置
說明
氘燈原本在可見區(qū)是沒有能量的，但是卻在656.1nm處出現(xiàn)一條氘燈的特定譜線，當氘燈的發(fā)射光束達到較佳位置時，這條特殊的譜線峰值也會達到最高，儀器正是利用這個峰值變化來監(jiān)控氘燈是否調(diào)整到較佳位置的。
6、略微緊固螺絲（切記不要太緊）接入電源，打開開關，看下光斑是否打在了狹縫上，如果未打在狹縫，可以通過緊固左右螺絲來微調(diào)光斑的位置
7、鎢燈更換完畢
老款機型氘燈的更換（主要講國產(chǎn)的）：
1、 跟更換鎢燈一樣，就是帶上手套，否則會污染氘燈，如果沒有條件的話也要把手洗干凈，防止手上的污跡污染氘燈，手指避免接觸光源中心發(fā)射空位置
2、 量取發(fā)射孔的立體位置
3、 松開氘燈底座三根引線
4、 旋松螺釘，收向上推氘燈底部
5、 根據(jù)之前量取角度拜訪氘燈位置，將放射孔位置調(diào)整至之前量取位置
注意事項：
(1) 光源鏡背部的螺釘A為燈光束垂直方向的調(diào)整螺釘，該螺釘調(diào)整時要兼顧兩個燈的能量，但主要照顧氘燈的能量，因為氘燈的能量是鎢燈的1/5。
(2) 雖然大多情況下僅僅更換一只光源燈，但調(diào)整時兩只燈的情況均要兼顧檢查。
(3)調(diào)整后要做儀器基線平坦度及噪聲水平的測試，以檢驗調(diào)整的效果。
(4)不同的分光儀器的燈室構造可能有所不同，但調(diào)整思路基本是一通百通的，本文僅能起到拋磚引玉的作用。
6、 開啟電源，點亮氘燈，調(diào)至度數(shù)最高，旋緊螺釘即可
新款機型鎢燈的更換不帶燈座的步驟同上，帶燈座的，直接安裝，安裝后只要調(diào)整螺絲松緊就能調(diào)節(jié)光斑，氘燈也是如此 。
光源燈更換后為何要調(diào)整？
分光光度計有一個技術指標，稱為“基線噪聲”，也就是“信噪比”，英文表示為S/N；簡單地講信噪比越大測量的結(jié)果精度越高。要想達到較佳信噪比，光源的調(diào) 整就凸現(xiàn)重要了；關于這個調(diào)整的物理意義，用儀器術語解釋：就是讓光源燈發(fā)出的實際光束與光路理論光軸完全重合。用形象語言解釋：就是讓光源發(fā)出的光束的 較強點完全照射到儀器單色器的入口狹縫的中央處。
由于安裝光源燈的燈座一般是固定式的，加之每支燈的構造的微小差異，致使其發(fā)射出的光束在三維空 間中的位置也不盡相同；所以更換光源燈后，很難保證光束的較強點照射到狹縫的中央處，這是客觀存在。為此、唯一可以補償這一缺憾的辦法就是調(diào)整光源鏡的反 射角度。但是對于許多使用者而言，往往不清楚這個調(diào)整步驟的重要性。一般來講、含有氘燈和鎢燈兩種光源的儀器的光源鏡均可以調(diào)整。
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