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高速冷凍離心機(jī)在分離細(xì)胞核基質(zhì)中的應(yīng)用 冷凍離心機(jī)如何做好保養(yǎng)

時(shí)間:2020-07-10    來源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     
核基質(zhì)是指真核細(xì)胞間核中除核被膜、染色體和核仁以外的一個(gè)精密網(wǎng)架系統(tǒng),既包含蛋白質(zhì),又包含RNA。核基質(zhì)是從純化的細(xì)胞核中分離的。要用去污劑、核酸酸處理細(xì)胞核。以分離核基質(zhì)的每一步中抑制核酸酶的活性非常重要。

本文介紹1986年Comerford使用過的分離細(xì)胞核基質(zhì)的方法和步驟。

1. 大鼠肝臟(50~100g)剪碎,加3倍體積的10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4,4℃)。勻漿后通過幾層紗布過濾,在4℃,勻漿液以800gmax(用的是MSE Chilspin離心機(jī),4*100ml轉(zhuǎn)子,2100r/min)離心10分鐘。把沉淀重新懸浮在勻漿緩沖液里,該緩沖液包含56%(質(zhì)量濃度)蔗糖,再在4℃以60000gmax(用Sorvall OTD50超速離心機(jī),A641轉(zhuǎn)子,28000r/min)離心90分鐘。把沉淀用20mL勻漿緩沖液洗兩次。

2. 把細(xì)胞核沉淀重新懸浮在20mL STEM緩沖液中[STEM:50mmol/L Tris-HCl,50mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖、1mmol/L EGTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4,4℃)],加入四硫酸鈉,終濃度為0.2mmol/L。在4℃孵育后,加入N-乙酰馬來酰亞胺(N-ethylmaleimide,NEM),終濃度為5mmol/L。

3. 在800 gmax離心沉淀細(xì)胞核,并用20mL STEM洗三次,把細(xì)胞核重新懸浮在20ml STEM中,補(bǔ)加20μg/mL DNase I(Boehringer, grade I),在37℃孵育20分鐘,再在800 gmax離心回收沉淀。

4. 把沉淀懸浮在20mL LS緩沖液里[LS緩沖液:10mmol/L Tris-HCl,0.2mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、10mmol/L PMSF(PH=7.4,4℃)] ,在4℃孵育10分鐘, 再在800 gmax離心10分鐘回收沉淀。

5. 把沉淀重新懸浮在1mL 含有70%(質(zhì)量濃度)蔗糖的LS緩沖液里。上面鋪放3層蔗糖梯度,各2ml 60%,50%和40%(質(zhì)量濃度)蔗糖(用含2mol/L NaCl的LS緩沖液配制蔗糖溶液)。在800 gmax離心1小時(shí),細(xì)胞核基質(zhì)在40%和50%蔗糖分離界面?;厥蘸笥肧TEM緩沖液(10ml)洗一次。

該方法可用于各種類型細(xì)胞核基質(zhì)的分離。  
  高速冷凍離心機(jī)儀器的故障分為必然性故障和偶然性故障。必然性故障是各種元器件、零部件經(jīng)長(zhǎng)期使用后,性能和結(jié)構(gòu)發(fā)生老化,導(dǎo)致儀器無法進(jìn)行正常的工作;偶然性故障是指各種元器件、結(jié)構(gòu)等因受外界條件的影響,出現(xiàn)突發(fā)性質(zhì)變,使儀器不能進(jìn)行正常的工作。出現(xiàn)故障的原因分為以下幾種。

1.儀器設(shè)備質(zhì)量缺陷引起的故障這類故障是由儀器元件(圖示94)質(zhì)量不好、設(shè)計(jì)不合理、裝配工藝上疏忽造成的故障。

2.高速冷凍離心機(jī)人為引起的故障這類故障是由于操作不當(dāng)引起的,—般多由操作人員對(duì)使用程序不熟練或不注意所造成的。故障輕者導(dǎo)致儀器不能正常工作,重者可能損壞儀器。因此在操作使用前,臺(tái)式低速大容量冷凍離心機(jī)毛細(xì)管等速電泳必須仔細(xì)閱讀儀器使用說明書,掌握正確的使用操作步驟’才能減少這類故障的發(fā)生。

3.外因所致的故障這類故障是由儀器設(shè)備的使用環(huán)境條件不符合要求引起的,常常是造成儀器故障的主要原因。一般指的是電壓、溫度、濕度、電場(chǎng)、磁場(chǎng)及振動(dòng)等。

4.高速冷凍離心機(jī)長(zhǎng)期使用后的故障這類故障與元件使用壽命有關(guān),因各種元件衰老所致,所以是必然故障,如光電器件、顯示器的老化、傳送機(jī)械系統(tǒng)的磨損等。

冷凍離心機(jī)的維護(hù)方法

 

    冷凍離心機(jī)是為了保持樣品的生物活性而設(shè)計(jì)的,一般轉(zhuǎn)速不會(huì)太高,所用角式轉(zhuǎn)頭多采用用鈦合金或鋁合金制成。主要用于收集微生物、細(xì)胞碎片、細(xì)胞、大的細(xì)胞器、硫酸沉淀物以及免疫沉淀物等。冷凍離心機(jī)因穩(wěn)定的性能,精細(xì)的做工,巧妙的設(shè)計(jì)贏得了眾多客戶的青睞。為保障離心機(jī)的正常運(yùn)行,應(yīng)清楚知道以下幾點(diǎn)。

  1、離心完畢后要擦干離心腔內(nèi)水分,定期對(duì)電機(jī)主軸的錐面上涂少許中性潤(rùn)滑油脂保護(hù),防止轉(zhuǎn)軸銹蝕。較長(zhǎng)時(shí)間不使用,應(yīng)將冷凍高速離心機(jī)的轉(zhuǎn)子取出,擦干凈放置在干燥的地方,防止銹蝕。

  2、不得隨意增加離心機(jī)的轉(zhuǎn)速,在使用6個(gè)月后,必須進(jìn)行全面保修一次,離心機(jī)長(zhǎng)時(shí)間不使用或者維修時(shí)應(yīng)將電源插頭取下。否則儀器會(huì)帶電,特別是維修時(shí)易發(fā)生安全事故。

  3、冷凍高速離心機(jī)為了保護(hù)制冷壓縮機(jī),儀器斷電與通電間隔時(shí)間必須大于3分鐘,否則損傷壓縮機(jī)。

  4、離心機(jī)在未使用時(shí),建議打開頂蓋,保持離心腔干燥,轉(zhuǎn)子不用時(shí)應(yīng)從離心腔內(nèi)取出,及時(shí)用中性洗滌液清潔擦干,防止化學(xué)腐蝕,存放在干燥通風(fēng)處。不允許用非中性清潔劑擦洗轉(zhuǎn)子,不允許用電熱風(fēng)吹()干轉(zhuǎn)子。轉(zhuǎn)子中心孔內(nèi)應(yīng)涂少許潤(rùn)滑脂保護(hù)。

  5、為保證冷凍效果,當(dāng)環(huán)境溫度高于30℃時(shí),應(yīng)對(duì)轉(zhuǎn)子和離心腔預(yù)冷,轉(zhuǎn)子還應(yīng)降低轉(zhuǎn)速15%運(yùn)轉(zhuǎn)。

6、離心管應(yīng)定期更新,嚴(yán)禁使用瀕臨破裂的離心管。

  7、離心機(jī)轉(zhuǎn)子使用時(shí)一定要確認(rèn)設(shè)置的轉(zhuǎn)子號(hào)正確無誤。若轉(zhuǎn)子號(hào)設(shè)置錯(cuò)誤。會(huì)造成轉(zhuǎn)子超速使用或達(dá)不到所需的離心效果。特別是超速使用可能發(fā)生轉(zhuǎn)子炸裂的惡性事故,萬(wàn)萬(wàn)不可疏忽大意。

  8、每次使用前應(yīng)注意檢查轉(zhuǎn)子有無腐蝕點(diǎn)和細(xì)微裂紋,禁止使用已腐蝕或有裂紋的轉(zhuǎn)子,使用超過保質(zhì)期的轉(zhuǎn)子,以保障人身安全。

  9、聚丙烯(PP)離心管()不能與王水、甲苯、苯、汽油、煤油等接觸使用。超凈工作臺(tái)聚碳酸酯(PC)離心管()不能與鹽酸(30%、50%)、硫酸(10%)、氫氧化鉀、氫氧化鎂、氫氧化氨、氟化鋁、硫化銨、醋酸銨、碳酸銨、鉻酸(50%)、甲苯、苯、汽油、乙醛、丙酮、乙醇、異丁醇、甲酚等接觸使用。聚乙烯(PE)離心管()不能與硫酸(50%、75%)、苯、汽油、煤油等接觸使用。

  



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