安捷倫液相色譜儀的規(guī)范操作
1. 目的：明確安捷倫液相色譜儀的規(guī)范操作，確保數(shù)據(jù)的準確性。
2. 范圍：適用于安捷倫液相色譜儀。
3. 職責：檢驗人員對此負責。
4. 操作規(guī)程：
4.1 系統(tǒng)組成
本系統(tǒng)由1個溶劑二元輸送泵（分主/A泵和副/B泵）、手動進樣閥、柱溫箱、檢測器、化學工作站和電腦等組成。
4.2 準備
4.2.1使用前應根據(jù)待檢樣品的檢驗方法準備所需的流動相，用合適的0.45μm濾膜過濾，超聲脫氣20min。
4.2.2 根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的色譜柱（柱進出口位置應與流動相流向一致）和定量環(huán)。
4.2.3 配制樣品和標準溶液（也可在平衡系統(tǒng)時配制），用合適的0.45μm濾膜過濾。
4.2.4 檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是否連接正常
4.1 將待測樣品按要求前處理，準備HPLC 所需流動相，檢查線路是否連接完好，廢液瓶是否夠用等。
4.3開機：
4.3.1 打開計算機,進入中文Windows XP畫面,并運行CAG Bootp Server程序。
4.3.2 打開 1200 LC 各模塊電源。
4.3.3 待各模塊自檢完成后，雙擊[Instrument 1 Online]圖標，化學工作站自動與1200LC
通訊，進入的工作站畫面如下所示。
4.3.4 從[視圖]菜單中選擇[方法和運行控制]畫面, 點擊[視圖]菜單中的[顯示頂部 工具欄]， [ 顯示狀態(tài)工具欄]，[系統(tǒng)視圖],[樣品視圖]，使其命令前有[√]標志，來調(diào)用所需的界面。
4.3.5 把流動相放入溶劑瓶中。
4.3.6 打開沖洗閥。
4.3.7 點擊[泵]圖標，點擊[設置泵…]選項，進入泵編輯畫面。
4.3.8 設流速：5ml/min，點擊[確定]。
4.3.9 點擊[泵] 圖標，點擊[控制…]選項，選中[啟動]，點擊[確定] ，則系統(tǒng)開始沖洗，直到管線內(nèi)（由溶劑瓶到泵入口）無氣泡為止,切換通道繼續(xù)沖洗，直到所有要用通道無氣泡為止。
4.3.10 點擊[泵] 圖標，點擊[控制…]選項，選中[關閉]，點擊[確定]關泵， 關閉沖洗閥。
4.3.11 點擊[泵]圖標，點擊 [設置泵…選項]，設流速：1.0ml/min。
4.3.12 點擊泵下面的瓶圖標，如下圖所示（以單元泵為例），輸入溶劑的實際體積和瓶體積。 也可輸入停泵的體積，點擊[確定]。
4.4 數(shù)據(jù)采集方法編輯
4.4.1開始編輯完整方法：從[方法]菜單中選擇[編輯完整方法…] 項，如下圖所示選中除[數(shù)據(jù)分析 ]外的三項，點擊[確定]，進入下一畫面。 4.4.2方法信息
4.4.2.1在[方法注釋]中加入方法的信息（如：測試方法）。 4.4.2.2 點擊 [確定]， 進入下一畫面。 4.4.3 泵參數(shù)設定
4.4.3.1 在[流速]處輸入流量,如1ml/min，在[溶劑 B]處輸入80.0,(A=100-B) ,也可[插入 ]一行[時間表] ,編輯梯度。在[壓力限]處輸入柱子的zui大耐高壓，以保護柱子。
4.4.3.2 點擊[確定]，進入下一畫面。
4.4.4 柱溫箱參數(shù)設定
4.4.4.1 在[溫度]下面的空白方框內(nèi)輸入所需溫度,如：40度。并選中它,點擊[更多>>] 鍵,如圖所示,選中[與左側(cè)相同]，使柱溫箱的溫度左右一致。
4.4.4.2 點擊[確定]，進入下一畫面。
4.4.5 檢測器參數(shù)設定：檢測波長：一般選擇zui大吸收處的波長。樣品帶寬：一般選擇zui大吸收值一半處的整個寬度。參比波長：一般選擇在靠近樣品信號的無吸收或低吸收區(qū)域 。參比帶寬：至少要與樣品信號的帶寬相等，許多情況下用100nm作為缺省值。同時可以輸入采集光譜方式，步長，范圍，閾值。選中所用的燈。
4.4.6 在[ 運行時選項表 ]中選中[ 數(shù)據(jù)采集]，點擊[確定]。
4.4.7 點擊[方法]菜單，選中[方法另存為…]，輸入一方法名，如[測試]，點擊[確定]。
4.4.8 從菜單 [視圖]中選中[在線信號],選中[信號窗口1],然后點擊[改變…] 鈕,將所要繪圖的信號移到右邊的框中,點擊[確定]。(如同時檢測二個信號,則重復10,選中[信號窗口2]。
單擊[改變]鍵，即可彈出右側(cè)的[編輯信號圖譜]窗口，進而選擇所需的譜圖信號。 4.4.9 從[運行控制]菜單中選擇[樣品信息]選項，如下圖所示，輸入操作者名稱，如[安裝工程師]；在[數(shù)據(jù)文件 ]中選擇[手動]或[前綴/計數(shù)器]。區(qū)別: 手動--每次做樣之前必須給出新名字,否則儀器會將上次的數(shù)據(jù)覆蓋掉。 Pr—在前綴/計數(shù)器----[前綴]框中輸入前綴，在[計數(shù)器]框中輸入計數(shù)器的起始位，儀器會自動命名，如vwd數(shù)據(jù)0001，vwd數(shù)據(jù)0002……。
4.4.10 點擊[確定] ,從[儀器] 菜單選擇[系統(tǒng)開啟]。
4.4.11 等儀器準備好，基線平穩(wěn)，用試樣溶液清洗注射器，并排除氣泡后抽取適量。
高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。與經(jīng)典的液相色譜相比，具有高效液相所用的固定相粒度?。?um-10um）、傳質(zhì)快、柱效高的優(yōu)勢。近年來，在保健食品功效成分、營養(yǎng)強化劑、維生素類、蛋白質(zhì)的分離測定等應用廣泛。世界上約有80％的有機化合物可以用HPLC來分析測定。
高效液相色譜的分離過程HPLC，借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。
高效液相色譜儀操作步驟：
1)過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。
2)對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。
3)打開HPLC工作站(包括計算機軟件和色譜儀)，連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。
4)進入HPLC控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。
5)一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進樣閥，需要在manual菜單下，先點擊purge，再點擊start，沖洗時速度不要超過10ml/min。
6)調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。點擊injure，選用合適的流速，點擊on，走基線，觀察基線的情況。
7)設計走樣方法。點擊file，選取selectusersandmethods，可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。若需建立一個新的方法，點擊newmethod。選取需要的配件，包括進樣閥，泵，檢測器等，根據(jù)需要而不同。選完后，點擊protocol。一個完整的走樣方法需要包括：a.進樣前的穩(wěn)流，一般2-5分鐘；b.基線歸零；c.進樣閥的loading-inject轉(zhuǎn)換；d.走樣時間，隨不同的樣品而不同。
8)進樣和進樣后操作。選定走樣方法，點擊start。進樣，所有的樣品均需過濾。方法走完后，點擊postrun，可記錄數(shù)據(jù)和做標記等。全部樣品走完后，再用上面的方法走一段基線，洗掉剩余物。
9)關機時，先關計算機，再關液相色譜。
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液相色譜儀在人們的生活中占有很大一部分，但是由于沒有認真的看說明書，導致一些操作上的問題，使液相色譜儀的使用壽命變短，那到底出現(xiàn)故障我們改怎么解決呢，這篇文章就是針對這個問題來進行討論的。
1、氣泡溢出
流動相內(nèi)有氣泡，關閉泵，打開泄壓閥，打開purg鍵，清洗脫氣，氣泡不斷從過濾器冒出，進入流動相，無論打開purge鍵幾次，都無法清除不斷產(chǎn)生的氣泡。原因過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi)，過濾器內(nèi)部由于霉菌的生長繁殖，形成菌團，阻塞了過濾器，緩沖液難以流暢地通過過濾器，空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過濾器進入流動相。處理過濾器浸泡于5%硝酸溶液中，超聲清洗幾分鐘即可；亦可將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小時，輕輕震蕩幾次，再將過濾器用純水清洗幾次，打開泄壓閥，打開purge鍵清洗脫氣，如仍有氣泡不斷從過濾器冒出，繼續(xù)將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中，如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出，說明過濾器內(nèi)部的霉菌菌團已被硝酸破壞，流動相可以流暢地通過過濾器。打開泄壓閥，打開泵，流速調(diào)至1.0～3.0ml/min，純水沖洗過濾器1小時左右。即可將過濾器清洗干凈。關閉泄壓閥，純甲醇沖洗半小時即可。
2、峰面積重復性不佳
(1)進樣閥漏液。
(2)加樣針不到位。
(3)液量不足。處理對于第一種情況更換進樣閥墊圈；對于第二種情況保證加樣針插到底，注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJECT狀態(tài)，以保證進樣量的準確。日常工作中，液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要，如要注意不要讓空氣進入輸液系統(tǒng)和高壓泵中，儲液器內(nèi)的溶液如長時間未用應清洗儲液器并更換溶液，每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈，防止無機鹽析出或沉積；樣品的前處理也很重要，任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì)，完全溶解，盡量減少對色譜柱的污染，以延長色譜柱的使用壽命，同時避免注射過濃的樣品溶液，以免殘留液在進樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞；色譜柱作好標記，用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。
3、柱壓高原因
(1)緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內(nèi)。
(2)樣品污染沉積。處理對于第一種情況先用40～50℃的純水，低速正向沖洗柱子，待柱壓逐漸下降后，相應提高流速沖洗，柱壓大幅度下降后，用常溫純水沖洗，之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘；對于第二種情況，由樣品的沉積引起污染的C18柱，和純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定)，再用換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。
4、既無壓力指示，又無液體流過
(1)泵密封墊圈磨損。
(2)大量氣泡進入泵體。處理對于第一種情況，更換密封墊圈；對于第二種情況，在泵作用的同時，用一個50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。
5、壓力波動大，流量不穩(wěn)定
原因系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物，使得兩者不能密封。處理工作中注意觀察流動相的量，保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底，避免吸入空氣，流動相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥，放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。
6、出峰不佳，峰分叉
(1)色譜柱被污染。
(2)柱頭填料塌陷。處理對于第一種情況，先用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定)，再換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳，則考慮第二種情況。對于第二種情況，擰開柱頭，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分(污染的填料)，裝入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平，滴甲醇，再壓緊反復幾次，直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈，擦凈柱外壁的填料，擰緊柱頭，用純甲醇沖洗30分鐘以上。
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