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高效液相色譜儀的原理及組成 液相色譜如何操作

時(shí)間:2020-07-06    來(lái)源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     
【導(dǎo)讀】發(fā)展歷史:1960年代,由于 氣相色譜對(duì)高沸點(diǎn)有機(jī)物分析的局限性,為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì),氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭(Kirkland)、哈

發(fā)展歷史:1960年代,由于

氣相色譜對(duì)高沸點(diǎn)有機(jī)物分析的局限性,為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì),氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭(Kirkland)、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺(tái)高效液相色譜儀,開啟了高效液相色譜的時(shí)代。高效液相色譜使用粒徑更細(xì)的固定相填充色譜柱,提高色譜柱的塔板數(shù),以高壓驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相,使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個(gè)小時(shí)甚至幾十分鐘內(nèi)完成。
1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實(shí)踐》一書,標(biāo)志著高效液相色譜法 (HPLC)正式建立。在此后的時(shí)間里,高效液相色譜成為較為常用的分離和檢測(cè)手段,在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與檢測(cè)、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜同時(shí)還極大的刺激了固定相材料、檢測(cè)技術(shù)、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理論的發(fā)展。
1960年代前,使用的填充粒大于100μm,提高柱效面臨著困境,后來(lái)的研究人員便采用微粒固定相來(lái)突破著一瓶頸??瓶颂m、荷瓦斯制備成功薄殼型固定相,這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼,實(shí)現(xiàn)了高速傳質(zhì),為高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展奠定了穩(wěn)固的基礎(chǔ)。隨著填料粒徑的降低,更高的柱效也得以實(shí)現(xiàn)。1960年代研制出氣動(dòng)放大泵、注射泵及低流量往復(fù)式柱塞泵,但后者的脈沖信號(hào)很大,難以滿足高效液相色譜的要求。1970年代,往復(fù)式雙柱塞恒流泵,解決了這一問(wèn)題。1970年代后科克蘭制備出全多孔球形硅膠,平均粒徑只有7μm,具有極好的柱效,并逐漸取代了無(wú)定形微粒硅膠。之后又制造出的鍵合固定相使柱的穩(wěn)定性大為提高,多次使用成為可能。1970年后,適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點(diǎn)。1980年后,改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問(wèn)題,人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到改變流動(dòng)相的組成事提高選擇性的關(guān)鍵。
高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)也叫高壓液相色譜(high pressure liquid chromatography)、高速液相色譜(high speed liquid chromatography)、高分離度液相色譜(high resolution liquid chromatography)等。是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上,于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻,小顆粒具有高柱效,但會(huì)引起高阻力,需用高壓輸送流動(dòng)相,故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。
高效液相色譜是目前應(yīng)用較多的色譜分析方法,高效液相色譜系統(tǒng)由流動(dòng)相儲(chǔ)液體瓶、輸液、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器和記錄器組成,其整體組成類似于氣相色譜,但是針對(duì)其流動(dòng)相為液體的特點(diǎn)作出很多調(diào)整。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相,被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相) 內(nèi), 由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù), 在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí), 經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過(guò)程, 各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別, 被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出, 通過(guò)檢測(cè)器時(shí), 樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來(lái)。
HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn);進(jìn)樣系統(tǒng)要求進(jìn)樣便利切換嚴(yán)密;由于液體流動(dòng)相粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣體,為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗,長(zhǎng)度也遠(yuǎn)小于氣相色譜柱。HPLC應(yīng)用非常廣泛,幾乎遍及定量定性分析的各個(gè)領(lǐng)域。
使用高效液相色譜時(shí),液體待檢測(cè)物被注入色譜柱,通過(guò)壓力在固定相中移動(dòng),由于被測(cè)物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同,不同的物質(zhì)順序離開色譜柱,通過(guò)檢測(cè)器得到不同的峰信號(hào),最后通過(guò)分析比對(duì)這些信號(hào)來(lái)判斷待側(cè)物所含有的物質(zhì)。高效液相色譜作為一種重要的分析方法,廣泛的應(yīng)用于化學(xué)和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒(méi)有本質(zhì)的差別,它的特點(diǎn)是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測(cè)器和高效微粒固定相,適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物。
高效液相色譜的特點(diǎn):
高壓——壓力可達(dá)150~300 kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。
高速——流速為0.1~10.0 mL/min。
高效——塔板數(shù)可達(dá)5000/米。在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。
高靈敏度——紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時(shí)消耗樣品少。
HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn):
速度快——通常分析一個(gè)樣品在15~30 min,有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。
分辨率高——可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到較佳分離效果。
靈敏度高——紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng,熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。
色譜柱可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少,容易回收——樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞,可以收集單一組分或做制備。?
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  【中國(guó)儀器網(wǎng) 使用手冊(cè)】色譜法,又稱“色層法”、“層析法”,早誕生于俄國(guó)植物學(xué)家——茨維特之手,后在此基礎(chǔ)上又相繼發(fā)展出薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法以及紙色譜法。目前,常見的液相色譜儀生產(chǎn)廠家有沃特世、安捷倫、島津、依利特、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。
 
  在液相色譜儀開機(jī)前,我們首先應(yīng)當(dāng)做好準(zhǔn)備工作,主要有配置試驗(yàn)要求的流動(dòng)相、安裝試驗(yàn)用的色譜、將流動(dòng)相過(guò)濾脫氣三點(diǎn)。流動(dòng)相的過(guò)濾,主要是為了除去流動(dòng)相中的微粒物質(zhì),所應(yīng)用到的濾膜可分脂溶性濾膜(有機(jī)濾膜)、水溶性濾膜與通用型濾膜。
 
  而流動(dòng)相的脫氣,則是為了流動(dòng)相防止在泵、流路、檢測(cè)器等儀器組成部分中產(chǎn)生氣泡,從而造成泵的不穩(wěn)定,并增加檢測(cè)器的噪音。據(jù)了解,氦氣脫氣、真空脫氣、超聲脫氣、加熱脫氣均可運(yùn)用于液相色譜儀的流動(dòng)相脫氣。脫氣的操作,需要以流動(dòng)相中的混合物濃度不發(fā)生變化為主要原則。
 
  另外,色譜柱的安裝調(diào)試,還涉及反相色譜柱與正相色譜柱兩種。反向色譜柱多以硅膠為基質(zhì),常以硅膠健合C18、C8為填料。值得一提的是,液相色譜儀還應(yīng)當(dāng)采用穩(wěn)定性較高的反相色譜柱。因?yàn)?,這種色譜柱還能夠承受酸與堿的作用。同時(shí),因存在著色譜儀遭受腐蝕的可能性,操作人員還應(yīng)當(dāng)勤勞更換每次試驗(yàn)用水,不使用鹵化物。后,為控制樣品在分析過(guò)程中的解離,操作人員還需注意反向色譜柱使用時(shí)的pH值,過(guò)高的pH值會(huì)溶解硅膠,過(guò)低的pH則會(huì)造成烷基的脫落。
 
  除上述幾個(gè)檢測(cè)的開機(jī)準(zhǔn)備工作以外,儀器設(shè)備本身的質(zhì)量、色譜條件、操作人員技術(shù)熟練程度、儀器安裝環(huán)境,都是影響著液相色譜儀發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素。不僅如此,儀器使用者還應(yīng)當(dāng)每三個(gè)月,就對(duì)液相色譜儀的清洗溶劑過(guò)濾器及溶劑瓶進(jìn)行清洗,以此來(lái)保證儀器長(zhǎng)時(shí)間、率的使用。



    在進(jìn)行液相色譜儀分析實(shí)驗(yàn)時(shí),流動(dòng)相再進(jìn)入儀器之前,必須使用超聲波清洗機(jī)進(jìn)行簡(jiǎn)單的除氣泡處理,以防對(duì)泵造成損害,對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成干擾。若在檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)液相色譜儀恒流泵里有氣泡,須及時(shí)進(jìn)行排除,排除高壓液相色譜儀泵中氣泡的方法如下。

    1、首先,檢查流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶中的溶劑過(guò)濾頭是否阻塞。具體做法:將輸入三通器上的溶劑塑料連接管的卸下,將流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶置于高位,利用壓差使溶液流出。如果溶劑流的很順暢,說(shuō)明溶劑過(guò)濾頭是好的。如果是一滴一滴的流出,則說(shuō)明過(guò)濾頭阻塞,需要超聲清洗,復(fù)原。

    2、用堵頭將儀器的高壓液流輸出口封住將色譜柱連在管路上、,可避免在抽液時(shí)將空氣抽入管路內(nèi)。將儀器所配的注射器及塑料連接管插到放空閥的導(dǎo)管上,逆時(shí)針旋開放空閥旋鈕,抽液5-10mL,將泵的流速設(shè)定在每分鐘一毫升的流速。啟動(dòng)泵,觀察塑料連接管的流動(dòng)溶液是否還有氣泡。如沒(méi)有氣泡說(shuō)明從過(guò)濾頭到放空閥這一段已將氣泡排除。

    3、將泵關(guān)閉,將堵頭從儀器的高壓液流輸出口去掉將色譜柱從管路上卸掉、使輸出口放空。順時(shí)針關(guān)閉放空閥旋鈕,將泵的流速設(shè)定在3-5mL的流速,將泵內(nèi)的阻尼器和壓力傳感器的氣泡趕出,流出溶液10-15mL將泵關(guān)閉。連接上色譜柱,將流速設(shè)定在每分鐘一毫升,啟動(dòng)泵,觀察壓力及壓力脈動(dòng)。

    4、用水和異丙醇甲醇、交替沖洗泵的內(nèi)腔,使吸附在內(nèi)墻壁上的氣泡趕出。

    5、應(yīng)用快速降壓法趕出氣泡:用小堵頭將泵的流動(dòng)相輸出口堵上,將流速設(shè)定在1毫升/分,將柱前壓力升至20Mpa左右,將排空閥快速打開,重復(fù)2~3即可。








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