熒光分光光度計是用于掃描液相熒光標記物所發(fā)出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù)，從各個角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。熒光分光光度計具有靈敏度高、選擇性強、用樣量少、方法簡便、工作曲線線形范圍寬等優(yōu)點，可以廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和藥理學(xué)、有機和無機化學(xué)等領(lǐng)域。
熒光分光光度計工作原理：
由光源氙弧燈發(fā)出的光通過切光器使其變成斷續(xù)之光以及激發(fā)光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光，被測的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過單色器變成單色熒光后照射于測樣品用的光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過放大器放大輸至記錄儀，激發(fā)光單色器和熒光單色器的光柵均由電動機帶動的凸輪所控制，當測繪熒光發(fā)射光譜時，將激發(fā)光單色器的光柵，固定在較為適當?shù)募ぐl(fā)光波長處，而讓熒光單色器凸輪轉(zhuǎn)動，將各波長的熒光強度訊號輸出至記錄儀上，所記錄的光譜即發(fā)射光譜（emissionspectrum），簡稱熒光光譜。
熒光分光光度計測試注意事項：
①樣品應(yīng)盛在四面透光的石英比色皿（熒光池）中，如果是揮發(fā)性樣品應(yīng)使用帶塞的熒光池。
②在熒光分析時，為了得到穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)，一般需要開機預(yù)熱氙燈大約30min。如果儀器光源采用的是閃爍氙燈，預(yù)熱時間可以縮短到10min左右。對某些易感光、易分解的熒光物質(zhì)，盡量采用長波長、低人射光強度及短時間光照。
③溫度變化可引起熒光強度的改變。通常降低溫度，有利于提高熒光量子產(chǎn)率，熒光強度增大。溫度影響熒光強度的顯著程度因樣品而異，大部分熒光物質(zhì)的熒光強度受溫度影響不大，測試溫度變化不超過±3℃，對測試結(jié)果幾乎無影響。
④當熒光物質(zhì)是弱酸或弱堿時，溶液的pH對熒光強度有較大影響。因為弱酸或弱堿在不同酸度中，分子和離子的電離平衡會發(fā)生改變，而熒光物質(zhì)的熒光強度會因其離解狀態(tài)發(fā)生改變。
⑤熒光物質(zhì)分子與溶液中其它物質(zhì)分子之間作用導(dǎo)致熒光強度降低，常見的熒光猝滅劑，如鹵素離子、重金屬離子、02、硝基化物質(zhì)、重氮化合物等。溶液中的溶解氧也能引起幾乎所有的熒光物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的熒光熄滅現(xiàn)象，因此，在較嚴格的熒光實驗中必須除02。
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分光光度計，又稱光譜儀(spectrometer)，是將成分復(fù)雜的光，分解為光譜線的科學(xué)儀器。測量范圍一般包括波長范圍為380~780 nm的可見光區(qū)和波長范圍為200~380 nm的紫外光區(qū)。不同的光源都有其特有的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源。鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的380~780nm波長的光譜光通過三棱鏡折射后，可得到由紅、橙、黃、綠、藍、靛、紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見光分光光度計的光源。
光度定義
分光光度法是在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進行定性或定量分析。常用的波長范圍為:(1)200~380nm的紫外光區(qū)，(2)380~780nm的可見光區(qū)，(3)2.5~25μm(按波數(shù)計為4000cm<-1>~400cm<-1>)的紅外光區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計(或比色計)、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和準確度，所有儀器應(yīng)按照國家計量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定，定期進行校正檢定。
儀器組成
分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。
儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成。
原理
分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光線透過測試的樣品后，部分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比，其關(guān)系如下式:
A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc
式中 :A 為吸光度;
I。為入射的單色光強度;
I 為透射的單色光強度;
T 為物質(zhì)的透射率;
k 為摩爾吸收系數(shù);
L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長;
c 為物質(zhì)的濃度;
物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應(yīng)用標準品或?qū)φ掌吠瑫r操作。
分光光度計是利用物質(zhì)對光的選擇性吸收進行物質(zhì)的定性或定量分析的儀器，在各行各業(yè)得到了廣泛應(yīng)用，主要用于物質(zhì)純度檢查、定量分析、物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒別等?？蓽y量結(jié)果總會出現(xiàn)可接受或不可接受的誤差，誤差來源于測量過程的各個方面，我認為主要來源于儀器本身性能和測量條件的選擇兩個方面。
一、儀器本身性能帶來的誤差
1.雜散光的影響
雜散光是指進人檢測器的處于待測波長光譜帶寬范圍外的其他波長組分，它是光譜測量中誤差的主要來源。產(chǎn)生原因有:分光光度計的色散元件、反射鏡、透鏡及單色器內(nèi)壁灰塵等。在分光光度計工作波段邊緣波長處，由于單色器透光率、光源輻射強度、檢測器靈敏度都較低，雜散光的影響更為顯著。雜散光限制儀器的分析上限可引起嚴重的測量誤差，實際工作中，在定量分析時，一般在吸收峰或其附近處測量樣品吸光度，如果在分析波長處含有雜散光，這時樣品的透光率較小，而雜散光大部分透過，使測量吸光度低于真實吸光度。
2.儀器噪聲對測量的影響
儀器噪聲也是儀器的一個重要指標，它表征儀器做稀溶液的能力。是疊加在待測量的分析信號中的不需要的信號，掃描100%T和0%T線，可觀察到分光光度計的絕對噪聲水平，如果儀器噪聲較大，會掩蓋較小的測量信號，一般用噪音的二倍來表示儀器的靈敏度。
3.波長和吸光度準確度
樣品的每一個值都是在一定的波長下測得的，如果波長誤差很大，測出的值肯定不準。吸光度準確度也是用戶對儀器的直接要求，更應(yīng)引起足夠的重視。國家計量檢定規(guī)程規(guī)定雙光束紫外可見分光光度計透射比準確度為A級士0.6%,B級土1.0%。
二、測量條件的選擇
1.吸光度范圍的選擇
試樣在不同吸光度時，濃度的相對誤差不同，一般選擇A二0.2一0.8之間，濃度相對誤差較小，可以通過改變吸收池厚度、檢測波長或待測溶液濃度，使吸光度讀數(shù)在適宜范圍內(nèi)。
2.狹縫寬度的選擇
狹縫寬度不僅影響光譜的純度，也影響吸光度值，在定量分析時，為了得到足夠的測量信號，應(yīng)采用較大狹縫。在定性分析時，為了提高分辨率，應(yīng)采用較小狹縫，以獲得精細的光譜結(jié)構(gòu)。
3.吸收池的選擇和使用
吸收池的規(guī)格應(yīng)根據(jù)被測溶液顏色深淺來確定，一般是被測溶液顏色深時選光程短的，顏色淺時選光程長的，同一實驗使用同一規(guī)格同一套吸收池。在定量測量之前需要對吸收池作校正和配對工作，吸收池不匹配時，對測量產(chǎn)生誤差，吸收池方向不同，透光率亦有差異，使用時應(yīng)注意方向。比色皿毛玻璃一面的上端有一個箭頭，應(yīng)與光路保持一致。另外，使用時，不要把溶液注得太滿，以防在推動比色皿架時溶液溢出皿外。如透光壁外有溶液存在，要擦干再測，否則將產(chǎn)生誤差。
分光光度計的正確使用和保養(yǎng)也很重要，我們應(yīng)該做到以下幾點:堅持標準溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，不使用過期溶液，比色皿應(yīng)保持清潔、干燥，禁止用硬物碰擦透明表面；防止儀器振動，影響測量穩(wěn)定性;在開機狀態(tài)，不測量時，應(yīng)打開樣品池門，延長光電傳感器壽命；樣品集中測量，避免開機次數(shù)，延長光源壽命；一旦停機，則應(yīng)待燈冷卻后再重新啟動，并預(yù)熱15min左右再使用；要經(jīng)常更換儀器的干燥劑，防止光學(xué)元件和光電傳感器受潮生霉；儀器搬動或更換重要部件后，要重新進行性能確認，以保證測量結(jié)果的準確。
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