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高效液相色譜儀的特點(diǎn) 液相色譜如何操作

時(shí)間:2020-07-05    來源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     
【導(dǎo)讀】高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、。分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。 1.進(jìn)樣系統(tǒng)一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高



    高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、。分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。


    1.進(jìn)樣系統(tǒng)一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作,進(jìn)樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。


    2.輸液系統(tǒng)該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。


    高壓泵的一般壓強(qiáng)為l。47~4。4X107Pa,流速可調(diào)且穩(wěn)定,當(dāng)高壓流動(dòng)相通過層析柱時(shí),可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng),可加快其在柱中的移動(dòng)速度,這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。


    流動(dòng)相貯存錯(cuò)和梯度儀,可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變,包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、PH值,或改用競爭性抑制劑或變性劑等。


    這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體)都能獲得有效分離。


    3.分離系統(tǒng)該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10~50cm(需要兩根連用時(shí),可在二者之間加一連接管),內(nèi)徑為2~5mm,由"優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成,住內(nèi)裝有直徑為5~10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成)。


    固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成,它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達(dá)1000?)和比表面積大的特點(diǎn),加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣),或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。


    因此,這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。


    例如,在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來。

 


    另外,固定相基質(zhì)粒小,柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài),極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)。基質(zhì)粒度小,微孔淺,樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。


    根據(jù)柱效理論分析,基質(zhì)粒度小,塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小,會(huì)提高分辨率的道理。


    再者,高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C,通過改善傳質(zhì)速度,縮短分析時(shí)間,就可增加層析柱的效率。





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液相色譜柱的使用和維護(hù)

    在液相色譜操作過程中,我們需要下面的問題,方便維護(hù)液相色譜柱。    A柱子在裝卸、更換時(shí),動(dòng)作要輕,接頭擰緊要適度。必須防止較強(qiáng)的機(jī)械振動(dòng),以免柱床產(chǎn)生空隙。    B.如果儀器用來做常規(guī)分析,樣品種類有限,但分析次數(shù)多,則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱,這樣有助于延長柱子的壽命。    C.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使液相色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料,因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行,在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩。    D.應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,特別是反相色譜中,不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?,反之亦然?nbsp;   E.如使用柱溫控制裝置時(shí),應(yīng)注意在通人流動(dòng)相后才能升溫。    F.一般說來液相色譜柱不能反沖,只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí),才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。    G.選擇使用適宜的流動(dòng)相,以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一個(gè)預(yù)柱,分析柱是鍵合硅膠時(shí),預(yù)柱為硅膠,可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”,避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。    H.避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi),需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一個(gè)保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。    I.經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗液相色譜柱,清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí),對流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡,每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右,即常規(guī)分析需要50-75mL。    J.保存液相色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇,柱接頭要擰緊,防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時(shí)間。    K.液相色譜柱使用過程中,如果壓力升高,一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞,這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)人柱內(nèi),使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形,則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,死體積增大。        L.在完成分離分析工作之后,不能馬上就關(guān)機(jī),需及時(shí)對色譜分析系統(tǒng)進(jìn)行沖洗,一般0.5h以上,以除去液相色譜柱內(nèi)的雜質(zhì)。

標(biāo)簽: 液相色譜柱
液相色譜柱 液相色譜柱的使用和維護(hù)_液相色譜柱
  液相色譜儀使用種的長常見故障處理
 
  1、氣泡溢出:流動(dòng)相內(nèi)有氣泡,關(guān)閉泵并打開泄壓閥清洗脫氣,氣泡從過濾器冒出進(jìn)入流動(dòng)相,無論打開purge鍵幾次,都無法清除不斷產(chǎn)生的氣泡。原因可能是過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi),霉菌生長繁殖形成菌團(tuán),阻塞了過濾器,緩沖液難以流暢地通過過濾器,空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過濾器進(jìn)入流動(dòng)相。
 
  處理過濾器浸泡于5%硝酸溶液中,超聲清洗幾分鐘即可;或?qū)⑦^濾器浸泡于5%硝酸溶液中12~36小時(shí),輕輕震蕩幾次,再用純水清洗幾次,打開泄壓閥清洗脫氣,如仍有氣泡不斷冒出,繼續(xù)將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中。
 
  2、柱壓高
 
  (1)緩沖液鹽分如沉積于柱內(nèi):先用40~50℃的純水低速正向沖洗柱子,待柱壓逐漸下降后提高流速?zèng)_洗,大幅度下降后常溫沖洗,之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘。
 
  (2)樣品污染沉積:樣品的沉積引起污染的C18柱,和純水反向沖洗柱子,換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子,再換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,末尾甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。
 
  3、無指示
 
  (1)泵密封墊圈磨損:更換密封墊圈
 
  (2)大量氣泡進(jìn)入泵體:在泵作用時(shí)用一個(gè)50ml的玻璃針筒在泵的出口處抽出空氣。
 
  4、不穩(wěn)定
 
  原因可能是系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間有異物,使兩者不能密封。處理工作中注意觀察流動(dòng)相的量,保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底,避免吸入空氣,流動(dòng)相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物,拆下單向閥,放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。
 
  5、峰分叉
 
  (1)色譜柱被污染:用純水反向沖洗柱子,然后換成甲醇沖洗,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子后換成甲醇沖洗,然后用純水沖洗,用甲醇正向沖洗柱子30分鐘以上。
 
  (2)柱頭填料塌陷:擰開柱頭,檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分(污染的填料),裝入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊,再填平,滴甲醇,再壓緊反復(fù)幾次,直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈,擦凈柱外壁的填料,擰緊柱頭,用純甲醇沖洗30分鐘以上。
 
  6、重復(fù)性差
 
  (1)進(jìn)樣閥漏液:更換進(jìn)樣閥墊圈。
 
  (2)加樣針不到位:保證加樣針插到底,注射樣品溶液須快速平穩(wěn)以保證準(zhǔn)確進(jìn)樣。


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