一、測定波長目前國內(nèi)常見的ELISA試劑盒所使用的標(biāo)記用酶均為辣根過氧化物酶(HRP)，底物通常為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和鄰苯二胺(OPD)，其在過氧化氫溶液的存在下，經(jīng)HRP作用，分別氧化為2,2,-二氨基偶氮苯(DAB)和聯(lián)苯醌。當(dāng)pH值為5.0左右時(shí)，DAB在450nm波長處有最大吸收，當(dāng)pH值降為L0時(shí)，最大吸收波長移至492nm,同時(shí)摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深，因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長450nm處有最大消光系數(shù)，如果HRP量少，H:O:和TMB過量時(shí)，則形成藍(lán)色的陽離子根。降低pH,即可使藍(lán)色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min.因此，450nm和492nm兩個(gè)波長是目前ELISA測定常用的。各種酶標(biāo)儀都配有放置濾光片的可自動(dòng)轉(zhuǎn)換的部件，可以同時(shí)安裝6~8片濾光片，所配備的濾光片均應(yīng)包括上述兩個(gè)波長，有的酶標(biāo)儀以490nm濾光片替代492nm濾光片，影響不大一般酶標(biāo)儀的測定波長在400~750nm或800nm之間，完全可以滿足ELISA的顯色測定。。除了這兩個(gè)基本濾光片外，考慮到雙波長比色的需要，還應(yīng)有620nm或630nm或650nm和405nm波長的濾光片，其他濾光片可根據(jù)自己的需要選擇。有時(shí)，有的實(shí)驗(yàn)室希望用酶標(biāo)儀作微量生化測定，故酶標(biāo)儀生產(chǎn)廠家對其生產(chǎn)的酶標(biāo)儀擴(kuò)展了紫外檢測功能，此時(shí)需要一個(gè)340nm波長濾光片。此時(shí)，酶標(biāo)儀的測定波長范圍就成為340-750nm或800nm。酶標(biāo)儀有單波長和雙波長檢測功能有時(shí)使用者不知在什么情況下使用單或雙波長檢測。所謂的“單波長”就是使用一種對顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進(jìn)行比色測定；而“雙波長”則除了用對顯色具最大吸收的波長即450nm或492nm進(jìn)行比色測定外，同時(shí)用對特異顯色不敏感的波長如630nm進(jìn)行測定，酶標(biāo)儀最后打印出來的吸光度則為二者之差。630nm波長下得到的吸光度是非特異的，來自于板子上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此，在ELISA比色測定中，可以使用雙波長，且不必設(shè)空白孔。

    二、測定的吸光度范圍通常，酶標(biāo)儀的吸光度測定范圍在。0-2.5之間即可以滿足ELISA的測定要求。早期的酶標(biāo)儀可測定的吸光度一般在0-2.5之間，但現(xiàn)在基本上都做了拓寬，可達(dá)到3.5以上，并且能保持很好的精密度與線性。如Labsystems公司DragonWellscanMK-2的吸光度測定范圍為0-3.5，而MultiskanAscent的吸光度測定范圍(Abs)達(dá)0-4.0，在0-4.0范圍，線性誤差不超過±2.0%，在0.3-3.0吸光度范圍內(nèi)，測定精密度CV小于±0.2%；3.0-4.0Abs范圍內(nèi)，測定精密度CV小于士0.2%。因此，對于酶標(biāo)儀的吸光度范圍不必去刻意追求大的吸光度范圍，主要要看在一定的吸光度范圍內(nèi)的線性和精密度如何。

    三、光學(xué)系統(tǒng)酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)采用的是垂直光路多通道(通常為8或12通道，亦有單通道)檢測，一般為硅光管或光導(dǎo)纖維，除測定通道外，有的酶標(biāo)儀還有一個(gè)參比通道，每次測定可進(jìn)行自我校準(zhǔn)。酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)功能如何，均可通過酶標(biāo)儀測定的吸光度范圍、線性度、精密度和準(zhǔn)確度等體現(xiàn)出來。光學(xué)系統(tǒng)好的話，則上述指標(biāo)也應(yīng)較佳。測定的精密度與測定通道之間的均一性有直接關(guān)系。單通道可避免因通道不同所致的差異。

適用：

利用酶聯(lián)免疫吸附測定法用于食品及飼料中三聚氰胺的定量測定。

檢測原理：

酶聯(lián)免疫吸附測定法定量測定三聚氰胺殘留。利用萃取液通過均質(zhì)及振蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進(jìn)行免疫測定。先將三聚氰胺酶標(biāo)記物，樣品萃取物及標(biāo)準(zhǔn)加入到已經(jīng)包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應(yīng)。在30分鐘的孵育過程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)記物競爭結(jié)合微孔中的三聚氰胺抗體，孵育30分鐘后洗掉小孔中所有沒有結(jié)合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標(biāo)記物。再用去離子水清洗結(jié)束后，每孔中加入清澈的底物溶液，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的物質(zhì)。孵育30分鐘后停止此反應(yīng)，根據(jù)各孔顏色深淺進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。

設(shè)備及材料：

1、具有450nm的酶標(biāo)分析儀

2、8頭或12頭洗板機(jī)(選配)

3、三聚氰胺檢測試劑盒

4、可吸取50ul的移液器及吸頭及.吸水紙

5、蒸餾水或去離子水

6、 20mM PBS： 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸餾水定容至1000ml.

7、清洗液：0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸餾水定容至1000ml.+0.5ml 土溫20樣品

飼料前處理：(稀釋倍數(shù)：20)

1、稱1g飼料樣品，加入4ml甲醇；

2、震蕩1min，加入0.1g氯化鈉；

3、4000轉(zhuǎn)離心5min；

4、取上清液0.2ml加入到0.8ml 20mMPBS中，混勻。

5、取150ul測定。

檢測：

1、先將三聚氰胺酶標(biāo)記物50ul，樣品150ul及標(biāo)準(zhǔn)150ul加入到已經(jīng)包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應(yīng)。

2、在30分鐘的孵育過程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)記物競爭結(jié)合微孔中的三聚氰胺抗體；

3、孵育30分鐘后用清洗液洗掉小孔中所有沒有結(jié)合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標(biāo)記物。清洗四次后，放在桌上用吸水紙吸掉微孔板里多余的水份；

4、清洗結(jié)束后，每孔中加入100ul清澈的底物溶液，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的物質(zhì)。

5、孵育30分鐘后加入100ul 停止液STOP停止此反應(yīng)，根據(jù)各孔顏色深淺進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值

結(jié)果分析：

1、半定量的結(jié)果是由樣品的吸光率與標(biāo)準(zhǔn)的吸光率的簡單對比而來判定：樣品的顏色比標(biāo)準(zhǔn)的顏色淺，則三聚氰胺的濃度比標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度高，樣品的顏色比標(biāo)準(zhǔn)的顏色深則三聚氰胺的濃度比標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度低。

2、定量分析需要繪制以標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光率為X軸,以標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度的半對數(shù)為Y軸的曲線圖。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣。吸光率的點(diǎn)畫成一直線,如此樣品的光吸收率可在線上找到,與此相對應(yīng)的Y軸則為樣品的濃度,樣品光吸收率。范圍應(yīng)比標(biāo)準(zhǔn)樣的最底范圍高,比最高范圍低, 即可說明此樣品中三聚氰胺的含量大于500ppb或小于20ppb。

特點(diǎn)：

本產(chǎn)品為酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)法，靈敏度高、檢測成本低，可適用于生產(chǎn)及檢驗(yàn)單位大批量快速篩查。