分光光度法是指應(yīng)用分光光度計(jì)的分析方法，具有靈敏、準(zhǔn)確、快速及選擇性好等特點(diǎn)。

    通常所測樣品溶液濃度下限可達(dá)10-6~10-5mol/L，適用于測定食品中的微量組分（如肉制品中的亞硫酸鹽、糖果中的二氧化硫等）。

    原理

    物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收

    當(dāng)光束照射到物質(zhì)上時(shí)，光與物質(zhì)發(fā)生相互作用，產(chǎn)生反射、散射、吸收或透射。

    若被照射的是均勻溶液，光的散射可以忽略。

    溶液顏色的產(chǎn)生

    當(dāng)一束白光通過某一有色溶液時(shí)，一些波長的光被溶液吸收，另一些波長的光則透過溶液。

    透射光或反射光刺激人眼使人感到顏色的存在。

    人把自身能感覺到的光定義為可見光。

    在可見光區(qū)，不同波長的光呈現(xiàn)不同的顏色，因此溶液的顏色由透射光的波長所決定。

    透射光與吸收光可組成白光，故稱這兩種光互為補(bǔ)色光，兩種顏色互為補(bǔ)色。

    光吸收的本質(zhì)

    當(dāng)一束光照射到某物質(zhì)或其溶液時(shí)，組成該物質(zhì)的分子、原子或離子與光子發(fā)生“碰撞”;

    光子的能量就轉(zhuǎn)移到分子、原子或離子上，是這些粒子由最低能態(tài)（基態(tài)）躍遷到較高能太（激發(fā)態(tài)），這個(gè)作用稱為物質(zhì)對(duì)光的吸收。

    被激發(fā)的粒子約在10-8s后回到基態(tài)，并以熱或熒光等形式釋放出能量。

    分子、原子或離子具有不連續(xù)的量子化能級(jí)，僅當(dāng)照射光光子的能量hυ，與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差相當(dāng)時(shí)，才能發(fā)生吸收。

    不同物質(zhì)微粒由于結(jié)構(gòu)不同而具有不同的量子化能級(jí)，其基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量差也不相同。

    所以物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性。

    吸收曲線

    吸收曲線，也稱為吸收光譜，描述了物質(zhì)對(duì)不同波長的光的吸收能力。

    將不同波長的光透過某一固定濃度和厚度的有色溶液，測量每一波長下有色溶液對(duì)光的吸收程度（即吸光度）；

    然后以波長為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作圖，繪制的曲線即為吸收曲線。

    不同濃度的同一物質(zhì)，在吸收峰附近的吸光度隨著濃度增加而增大，但最大吸收波長不變。

    若在最大吸收波長處測定吸光度，則靈敏度最高。

    因此，吸收曲線是分光光度法中選擇測定波長的重要依據(jù)。

    光吸收基本定律

    即朗伯-比爾定律：

    當(dāng)一束平行單色光通過液層厚度為b的有色溶液時(shí)，溶質(zhì)吸收了光能，光的強(qiáng)度就要減弱。

    溶液的濃度越大，通過的液層厚度越大，入射光越強(qiáng)，則光被吸收的越多，光強(qiáng)度的減弱也越顯著。

    該定律是紫外可見分光光度法等各類吸光光度法定量分析的依據(jù)，是由實(shí)驗(yàn)觀察得到的，不僅適用于溶液，也適用于其他均勻非散射的吸光物質(zhì)。

    A=lg(I/I0)=εbc

    A-吸光度；

    I0-入射光強(qiáng)度，cd；

    I-透射光強(qiáng)度，cd；

    ε-吸光系數(shù)，L/(mol˙cm)；

    b-液層厚度（光程長度），cm；

    c-有色溶液的濃度，mol/L。

    其物理意義為：

    當(dāng)一束平行單色光通過單一均勻、非散射的吸光物質(zhì)溶液時(shí)，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。

    式中ε是吸光物質(zhì)在特定波長和溶劑的情況下的一個(gè)特征常數(shù)，數(shù)值上等于濃度為1mol/L的吸光物質(zhì)在1cm光程中的吸光度。

    ε是吸光物質(zhì)吸光能力的量度，ε值越大，方法的靈敏度越高。

    由實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算ε時(shí)，常以被測物質(zhì)的總濃度代替吸光物質(zhì)的濃度，實(shí)際上時(shí)表觀摩爾吸光系數(shù)。

    在多組分體系中，如果各種吸光物質(zhì)之間沒有相互作用，體系的總吸光度等于各組分吸光度之和，即吸光度具有加和性。

    透光度T是透射光強(qiáng)度I與入射光強(qiáng)度I0之比，即：

    T=I/I0

    因此：A=lg(1/T)