高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μM。適用于分離分子量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。
2．液液色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔體表面，或化學鍵合于擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。
涂布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用。現(xiàn)在多采用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應用較為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個HPLC應用的80%左右。
隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現(xiàn)已應用于某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的PH值。但需要注意的是，C18和C8使用的PH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的PH值會使硅膠溶解，太低的PH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在PH 1.5~10范圍操作。
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造成液相色譜儀流動相供給不暢的原因可能是：流動相已經(jīng)接近用完了，管路中吸入氣體引起泵壓力不穩(wěn)定?！ ?jīng)常觀察貯液器中流動相的量，加足流動相保證所有樣品分析完畢。輸液管路上安裝沉子至瓶底，貯液器蓋上留一小孔正好夾住進液器，使其不能上下移動?！ ∵^濾器阻塞會引起管道和泵腔真空變化，使壓力不穩(wěn)。當過濾器被微粒所阻塞或長霉時，去掉過濾器后系統(tǒng)會運轉(zhuǎn)正常，換上新的過濾器即可，有時候換上新過濾器任然不暢，那么就需要檢查流動相的制備過程，或者換上大孔徑的過濾器。不管如何，流動相都要重新過濾?！ ×魉龠^高、阻力大，造成真空化現(xiàn)象，這是由于過濾器孔徑、管道內(nèi)徑、流速和溶劑粘度等引起的。如果流速大于10mL/min，常會出現(xiàn)這種現(xiàn)象，試著用下列方法解決?！ ?、試用低流速，若問題解決了則再進行下一步； 2、換大孔徑的過濾器； 3、增加進液管內(nèi)徑； 4、抬高或加壓貯液器； 5、改低流速； 6、不用入口過濾器（但流動相一定要先過濾）。 當貯液器蓋子太緊，在貯液器內(nèi)形成真空，打出的流動相不連續(xù)。應松開蓋子或留有1mm縫隙。 進液管路阻塞或彎曲折疊會使泵抽不到液，注意調(diào)整進液路道或更新。
高效液相色譜和氣相色譜在基本理論方面沒有顯著不同，它們之間的重大差別在于作為流動相的液體與氣體之間的性質(zhì)的差別?！ 「咝б合嗌V分析原理： 一、高效液相色譜分析的流程：由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測量之后，導入進樣器。被測物由進樣器注入，并隨流動相通過色譜柱，在柱上進行分離后進入檢測器，檢測信號由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復雜的混合物分離極性范圍比較寬、還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動相極性，使樣品各組分在較佳條件下得以分離?！ 《?、高效液相色譜的分離過程：同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離?！ 《?、高效液相色譜的分離過程：同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離?！ ￠_始樣品加在柱頭上，假設(shè)樣品中含有3個組分，A、B和C，隨流動相一起進入色譜柱，開始在固定相和流動相之間進行分配。分配系數(shù)小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯留時間長，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A，C之間，第二個流出色譜柱。若一個含有多個組分的混合物進入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達到分離之目的?！ 〔煌M分在色譜過程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學平衡問題，也是分離的首要條件。其次，當不同組分在色譜柱中運動時，譜帶隨柱長展寬，分離情況與兩相之間的擴散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動相的流速等有關(guān)。所以分離最終效果則是熱力學與動力學兩方面的綜合效益。
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