色譜柱在使用前，可以進行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是較佳條件)，只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。
1、樣品的前處理：
a、可以使用流動相溶解樣品。
b、使用予處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。使用0.45?m的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動相的配制：
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。
b、流動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學反應(特殊情況除外)。
c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果;同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，可以使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導致實驗無法進行。
f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動相流速的選擇：
因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求較佳柱效，可以使用較佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。
當選用較佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。
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高效液相色譜儀適宜于分離、分析高沸點、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質(zhì)，因而廣泛為化學、醫(yī)學、工業(yè)、農(nóng)學、商檢和法檢等學科領域中針對這種精密而又運用廣泛的科學儀器。
下面我們來聊一聊基線。HPLC常見的基線問題主要有基線漂移以及基線噪音。
基線漂移
線漂移基線漂移是色譜工作者普遍遇到的問題。一般說來，機器剛起動時，基線容易漂移，大概要30min的平衡時間，如果用了緩沖溶液、緩沖鹽，或者在低波長下(220nm)平衡時間相對會比較長，仍然發(fā)現(xiàn)基線漂移，原因可能有以下幾種：
1、柱溫波動
控制好柱子和流動相的溫度，檢查是否有打開的窗戶或空調(diào)對著柱溫箱。
2、流通池被污染或有氣體
用甲醇或其他強極性溶劑沖洗流通池(盡量斷開柱子)。如有需要，可以用1N的硝酸(不要用鹽酸)。
3、紫外燈能量不足
更換新的紫外燈
4、流動相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。檢查流動相的組成，使用高品質(zhì)的化學試劑及HPLC級的溶劑。
基線噪音
對于紫外檢測器,氘燈光源打開后要預熱30min以上,基線才能穩(wěn)定。噪聲是指與被測物無關的檢測器輸出信號的隨機擾動變化,分短期噪聲和長期噪聲兩種。
基線噪音(規(guī)則的)
產(chǎn)生基線噪音的原因有：在流動相、檢測器或泵中有空氣;漏液;流動相混合不完全;溫度影響(柱溫過高,檢測器未加熱);在同一條線上有其他電子設備;泵振動。
了避免基線噪音,在正式進樣之前,需要對流動相脫氣;沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣;檢查管路接頭是否松動;泵是否漏液;是否有鹽析出和不正常的噪音,如有必要,更換泵密封;用手搖動使溶劑混合均勻或使用低粘度的溶劑減少差異或加上熱交換器;有其他電子設備時斷開LC、檢測器和記錄儀,檢查干擾是否來自于外部,加以更正;泵振動時在系統(tǒng)中加入脈沖阻尼器。
基線噪音(不規(guī)則的)
(1)漏液：檢查接頭是否松動,泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要,更換密封,檢查流通池是否漏液。
(2)流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成：檢查流動相的組成。
(3)流動相各溶劑不相溶：選擇互溶的流動相。
(4)檢測器/記錄儀電子元件的問題：斷開檢測器和記錄儀的電源,檢查并更正。
(5)系統(tǒng)內(nèi)有氣泡：用強極性溶液清洗系統(tǒng);檢測器內(nèi)有氣泡,清洗檢測器,在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器。
(6)流通池污染(即使是極少的污染物也會產(chǎn)生噪音):用硝酸清洗流通池;
(7)檢測器燈能量時不足更換燈;
(8)色譜柱填料流失或阻塞:更換色譜柱。
(9)流動相混合不均勻或混合器工作不正常:維修或更換混合器,在流動相不走梯度時,不建議使用泵的混合裝置。
高效液相色譜儀操作步驟如下：
1)過濾流動相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜.
2)對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20分鐘。
3)打開hplc工作站（包括計算機軟件和色譜儀），連接好流動相管道，連接檢測系統(tǒng)。
4)進入hplc控制界面主菜單，點擊manual，進入手動菜單。
5)有一段時間沒用，或者換了新的流動相，需要先沖洗泵和進樣閥。
6)調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過2000。
7)設計走樣方法。
8)進樣和進樣后操作。
9)關機時，先關計算機，再關液相色譜。
10)填寫登記本，由負責人簽字。
11)流動相均需色譜純度，水用20m的去離子水。
12)柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要讓液體過柱子。
13)所有過柱子的液體均需嚴格的過濾。
14)壓力不能太大，可以不要超過2000psi。
高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。
1.漂移 漂移是指儀器穩(wěn)定后一段時間內(nèi)基線漂離原點的距離，通常用來衡量儀器穩(wěn)定快慢。高品質(zhì)的儀器能在較短的時間內(nèi)達到穩(wěn)定，從而在一定程度上提高了分析效率。 2.系統(tǒng)的，整體開發(fā) 這里指的是儀器的整體開發(fā)，是一個完整的系統(tǒng)。目前市場上有這個現(xiàn)象，說我的泵是進口的，或者是檢測器怎么好，用了什么很多的進口件組裝等等。其實這是個誤區(qū)。液相色譜是個復雜的系統(tǒng)，不是整體開發(fā)的，各項指標之間、軟件和硬件、硬件和硬件等都不匹配，整體水平不會高到哪里去，而且在售后服務方面對用戶也是不負責任的。 整體開發(fā)的主要優(yōu)點有：各項技術(shù)指標統(tǒng)一、儀器各單元的通信協(xié)調(diào)、能夠建立一個整體的數(shù)字化評價系統(tǒng)、體現(xiàn)了企業(yè)的科技及開發(fā)實力。 3.操作方便 操作方便性無論是對新手還是成熟的用戶都是很重要的。液相色譜儀的操作越簡單，有利于提高分析效率，也為以后分析方法的拓展提供有力的幫助。上海伍豐科學儀器有限公司的WS-100工作站軟件實現(xiàn)了真正的智能化操作。它摒棄了以往工作站軟件只能起到數(shù)據(jù)處理的理念，率先在國內(nèi)推出了集控制與后處理于一身的軟件，在操作使用上給用戶帶來了極大的方便。是反映儀器靈敏度的重要參數(shù)。CL=2×Nd×C/H(CL ：最小檢測濃度 Nd:噪音 C：樣品濃度最小檢測濃度 H：樣品峰高)由上式可見，最小檢測濃度是和噪音成正比的，噪音越大，最小檢測濃度就越大，靈敏度就越低。某些山東液相色譜儀廠家回避了這個指標，說明他們不愿在最小檢測濃度的基礎上去比較噪音. 4.噪音 噪音是指由儀器的電器元件、溫度波動、電壓的線性脈沖以及其他非溶質(zhì)作用產(chǎn)生的高頻噪聲和基線的無規(guī)則波動。噪音的大小直接關系到儀器的檢測靈敏度，噪音越大，檢測的靈敏度就越低。對于檢測低含量的樣品就要求儀器的噪音越小越好，否則噪音過大將會導致基線不穩(wěn)，甚至影響分析結(jié)果。 5.定性定量重復性 國產(chǎn)液相色譜儀廠家認為主要是考核儀器穩(wěn)定性的指標，這對于分析樣品來說是非常重要的。好的儀器其穩(wěn)定性應該是十分優(yōu)秀的，這就要求多次進樣保留時間及含量的一致性，這樣做出來的結(jié)果才能使人信服。選擇液相色譜儀的技巧
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