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液相色譜柱使用過程中應(yīng)當(dāng)著重注意的問題 液相色譜如何操作

時間:2020-06-30    來源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     
【導(dǎo)讀】色譜柱在色譜儀分析系統(tǒng)中起著分離作用,是色譜分析的核心部件。正確使用和維護色譜柱尤為重要,使用不當(dāng)就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。以下從幾個方面簡單



    色譜柱色譜儀分析系統(tǒng)中起著分離作用,是色譜分析的核心部件。正確使用和維護色譜柱尤為重要,使用不當(dāng)就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。以下從幾個方面簡單介紹液相色譜柱在使用過程中應(yīng)當(dāng)著重注意的問題。

    一、避免壓力和溫度的急劇變化

    溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料,因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進行,以保持色譜柱內(nèi)填料的穩(wěn)定性。

    二、避免直接改變?nèi)軇┑慕M成

    在需要改變檢測樣品溶液組成是,應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,特別是反相色譜中,不應(yīng)直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳?。且在使用次洗脫能力強的洗脫液沖洗色譜柱時,對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡,每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右,即常規(guī)分析需要50~75ml。

    三、避免色譜柱反沖

    一般來說色譜柱不能反沖,只有色譜柱使用說明書上標(biāo)明該柱可反沖才可以反沖除去留在柱頭上的雜質(zhì)。否則,反沖色譜柱的影響是迅速降低柱效。

    四、避免流動相使用不當(dāng)而破壞固定相

    選擇使用適宜的流動相(尤其是pH),以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一段預(yù)柱,分析柱是鍵合硅膠時,預(yù)柱為硅膠,可使流動相在進入分析柱之前預(yù)先被硅膠"飽和",避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。

    五、禁止樣品未經(jīng)處理直接進入色譜柱

    避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi),需要對樣品進行預(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。

    六、禁止將緩沖溶液長時間存放在色譜柱內(nèi)

    保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇,柱接頭要擰緊,防止溶劑揮發(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。

    七、禁止色譜柱未經(jīng)處理直接封存

    色譜柱使用完成之后須使用相宜溶劑進行清潔處理,例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡;當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動相時,使用完后應(yīng)用無鹽流動相沖洗;含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道,不宜長期與之接觸;裝在液相色譜儀上的色譜柱如不經(jīng)常使用,應(yīng)每隔4-5天開機沖洗15分鐘。





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色譜柱是高效液相色譜儀的重要組成部分,在色譜儀分析系統(tǒng)中起著分離作用,是色譜分析的核心部件,對高效液相色譜柱的正確使用不僅能延長色譜柱的使用壽命,還能有效保證實驗結(jié)果。

 

以下簡單介紹液相色譜柱

在使用過程中應(yīng)當(dāng)注意的問題

 

01

性能測試

 

新色譜柱使用前,應(yīng)進行柱的性能測試,并將結(jié)果保存起來,作為今后評價柱性能變化的參考依據(jù) (柱性能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異有所不同,在測試中需保證方法一致性)。

 

02

流動相的配制

 

液相色譜是通過樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的,因此要求流動相具備以下的特點:

 

  • 流動相對樣品具有一定的溶解能力,保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。

  • 流動相具有一定惰性,與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。

  • 流動相的黏度要盡量小,以便在使用較長的分析柱時既能得到好的分離效果,同時又降低柱壓,延長柱子的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。

  • 流動相的物化性質(zhì)與使用的檢測器相適應(yīng)。

  • 流動相沸點不要太低,否則容易產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實驗無法進行。

  • 流動相配制好后,一定要進行脫氣,除去溶解在流動相中的微量氣體。

 

03

新色譜柱使用前沖洗步驟

 

1、首先查看色譜柱的說明書,注意色譜柱封存的溶劑、推薦流速、pH值、耐受柱壓、及使用溫度等信息。

2、如分析使用的流動相與色譜柱內(nèi)儲存的溶劑混溶,可以直接使用流動相參照色譜柱說明書中推薦的流速、溫度等條件沖洗色譜柱20倍柱體積以上。如果分析條件使用的流動相與色譜柱內(nèi)儲存的溶劑不混溶,請選擇與色譜柱內(nèi)儲存溶劑和流動相都混溶的溶劑,作為置換溶劑,逐步置換到分析使用的流動相。每次置換均應(yīng)沖洗色譜柱20倍柱體積以上。

  

04

日常使用注意事項

 

1、請使用HPLC級別以上的試劑作為流動相。

2、流動相要用0.45um孔徑以下的微孔濾膜濾過。

3、流動相的pH值不能超出色譜柱的適用范圍。

4、注意流動相的流動方向要與色譜柱標(biāo)識的方向一致。

5、容易滋生微生物的流動相不要存放過久,要及時換新,以免微生物滋生污染色譜柱。

6、色譜柱分析結(jié)束后要及時徹底沖洗。

7、長時間不用的色譜柱要將流動相置換為色譜柱保存的溶劑,并兩端用堵頭封死保存。

8、色譜柱要避免劇烈碰撞、跌落等。

 

 

05

流動相流速的選擇

 

因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù),使用不用的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱,要追求較佳柱效,應(yīng)使用zui佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,流速一般選擇1mL/min,對于內(nèi)徑4.0mm柱,流速0.8mL/min為更佳。當(dāng)選用zui佳流速時,分析時間可能延長??刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間(如使用反相柱時,可適當(dāng)增加有機試劑甲醇或乙腈的含量)。

 

液相色譜柱在色譜分析中起著至關(guān)重要的角色,是樣品分離的核心,正確使用色譜柱才能達到更好的理想的分離效果,提高色譜柱的使用壽命。

 

 

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  • 譜峰解析精靈

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有關(guān)高效液相色譜儀的使用

    系統(tǒng)一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。

    其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部位。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、與柱或保護住、柱溫控制器等,現(xiàn)代HPLC儀還有微機控制系統(tǒng),進行自動化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。

 

    下面就介紹下高效液相色譜使用中的幾個重要環(huán)節(jié)吧。

    實驗前的準(zhǔn)備工作

    1.過濾流動相。為了保證流動相潔凈,流動相使用前都必須微膜過濾。

    2.流動相脫氣。為了避免流動相中氣泡對儀器(氣泡可能會對儀器及相關(guān)設(shè)備的正常使用及壽命產(chǎn)生一定影響)及分析結(jié)果的影響。

    3.運行液相泵前盡量先清洗泵柱塞部件。清洗液一般采用10%甲醇溶液,也有采用10%異丙醇溶液

    (5%甲醇或異丙醇等有機相溶液能避免微生物污染,但濃度不能太高,高于20%緩沖液可能會導(dǎo)致鹽結(jié)晶析出,碰到酸堿類物質(zhì)可能會有比較強烈的反應(yīng);另外異丙醇粘度較大,清洗能力較強;也有采用純水清洗的,這樣如果儀器每天使用還行,如果長期不用,為了防止微生物繁殖,純水還得用含有有機相的清洗液置換出去)

    沖洗,這是為了保護泵柱塞和密封圈等部件在泵運行時不被結(jié)晶鹽等磨損而導(dǎo)致泵頭漏液。

    4.每天運行儀器前先排氣。一般的液相色譜儀都有排氣功能,沒有的可以不接色譜柱開機運行幾分鐘排氣。

    5.泵運行時盡量不采用大流量模式(主要是換流動相或排氣泡等,流量盡量設(shè)為3.0ml/min以內(nèi),這樣更有利于保護泵柱塞桿和密封圈等部件的壽命)。

    6.分析前先對色譜系統(tǒng)(整個流路)進行沖洗及平衡,尤其是色譜柱。先用純甲醇沖洗30分鐘,再換10%甲醇水溶液沖洗30分鐘,最后換含緩沖鹽或酸堿類物質(zhì)的流動相平衡30分鐘。色譜柱如果長期沒用,每一步?jīng)_洗、平衡量盡量為色譜柱柱容量20倍以上)。

    如果流動相中不含緩沖鹽或酸堿類物質(zhì),純甲醇沖洗完可直接換為流動相。使用色譜柱前知道或懷疑色譜柱中殘留有或酸堿鹽類物質(zhì),在用純甲醇沖洗前增加一步10%甲醇水溶液沖洗。

    7.如果色譜柱需要控溫(升溫),要先運行泵后再設(shè)柱溫箱溫度。

    8.待儀器運行穩(wěn)定后(基線基本走平后,這個是經(jīng)驗值),方可進樣。

    樣品前處理

    1.樣品濃度不要太大,雜質(zhì)不要太多,否則色譜柱處理起來壓力很大。

    2.進樣前樣品一定得先經(jīng)微膜(一般采用0.22um或0.45um微膜)過濾。

    實驗過程中注意事項

    1.為了避免進樣器殘留影響,進樣前先對進樣器進行清洗(這個不是必須的,但盡量是每進一針樣品或標(biāo)準(zhǔn)品前都清洗進樣器和進樣針,當(dāng)然同一樣品也可以不洗,不同樣品盡量洗),清洗順序為純水、甲醇、流動相。

    2.每進一針樣品后要對系統(tǒng)進行一次沖洗、平衡后再進下一針樣品(等度要求不高,梯度要求相對高,主要是沖洗色譜柱中殘留的強保留物質(zhì))。

    實驗完畢的后續(xù)工作

    1.做完樣要先清洗進樣器,清洗順序為純水、甲醇。

    2.關(guān)閉柱溫箱溫度設(shè)置。

    3.沖洗色譜系統(tǒng)及色譜柱。先用10%甲醇水溶液沖洗30分鐘后換為純甲醇沖洗30分鐘,待基線基本走平停泵。如果流動相中不含緩沖鹽或酸堿類物質(zhì),沖洗時流動相可直接換為純甲醇。色譜柱用完后如果長時間內(nèi)不會再用,純甲醇沖洗量要大于色譜柱柱容量20倍以上的,沖洗后卸下,兩端密封保存。

    4.待色譜柱溫度降至接近于室溫時再停泵、關(guān)機(這一點需特別注意,目的是防止溫度過高損壞色譜柱)。

    5.關(guān)機前用清洗液清洗柱塞桿。

標(biāo)簽: 液相色譜儀
液相色譜儀 有關(guān)高效液相色譜儀的使用_液相色譜儀

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