色譜柱在色譜儀分析系統(tǒng)中起著分離作用，是色譜分析的核心部件。正確使用和維護色譜柱尤為重要，使用不當(dāng)就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。以下從幾個方面簡單介紹液相色譜柱在使用過程中應(yīng)當(dāng)著重注意的問題。
一、避免壓力和溫度的急劇變化
溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進行，以保持色譜柱內(nèi)填料的穩(wěn)定性。
二、避免直接改變?nèi)軇┑慕M成
在需要改變檢測樣品溶液組成是，應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳?。且在使用次洗脫能力強的洗脫液沖洗色譜柱時，對流路系統(tǒng)中流動相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75ml。
三、避免色譜柱反沖
一般來說色譜柱不能反沖，只有色譜柱使用說明書上標(biāo)明該柱可反沖才可以反沖除去留在柱頭上的雜質(zhì)。否則，反沖色譜柱的影響是迅速降低柱效。
四、避免流動相使用不當(dāng)而破壞固定相
選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一段預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預(yù)先被硅膠"飽和"，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
五、禁止樣品未經(jīng)處理直接進入色譜柱
避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進行預(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
六、禁止將緩沖溶液長時間存放在色譜柱內(nèi)
保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。
七、禁止色譜柱未經(jīng)處理直接封存
色譜柱使用完成之后須使用相宜溶劑進行清潔處理，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡；當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動相時，使用完后應(yīng)用無鹽流動相沖洗；含鹵族元素（氟、氯、溴）的化合物可能會腐蝕不銹鋼管道，不宜長期與之接觸；裝在液相色譜儀上的色譜柱如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4-5天開機沖洗15分鐘。
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色譜柱是高效液相色譜儀的重要組成部分，在色譜儀分析系統(tǒng)中起著分離作用，是色譜分析的核心部件，對高效液相色譜柱的正確使用不僅能延長色譜柱的使用壽命，還能有效保證實驗結(jié)果。
以下簡單介紹液相色譜柱
在使用過程中應(yīng)當(dāng)注意的問題
01
性能測試
新色譜柱使用前，應(yīng)進行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考依據(jù) (柱性能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異有所不同，在測試中需保證方法一致性）。
02
流動相的配制
液相色譜是通過樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）。
流動相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。
流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時既能得到好的分離效果，同時又降低柱壓，延長柱子的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度）。
流動相的物化性質(zhì)與使用的檢測器相適應(yīng)。
流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進行。
流動相配制好后，一定要進行脫氣，除去溶解在流動相中的微量氣體。
03
新色譜柱使用前沖洗步驟
1、首先查看色譜柱的說明書，注意色譜柱封存的溶劑、推薦流速、pH值、耐受柱壓、及使用溫度等信息。
2、如分析使用的流動相與色譜柱內(nèi)儲存的溶劑混溶，可以直接使用流動相參照色譜柱說明書中推薦的流速、溫度等條件沖洗色譜柱20倍柱體積以上。如果分析條件使用的流動相與色譜柱內(nèi)儲存的溶劑不混溶，請選擇與色譜柱內(nèi)儲存溶劑和流動相都混溶的溶劑，作為置換溶劑，逐步置換到分析使用的流動相。每次置換均應(yīng)沖洗色譜柱20倍柱體積以上。
04
日常使用注意事項
1、請使用HPLC級別以上的試劑作為流動相。
2、流動相要用0.45um孔徑以下的微孔濾膜濾過。
3、流動相的pH值不能超出色譜柱的適用范圍。
4、注意流動相的流動方向要與色譜柱標(biāo)識的方向一致。
5、容易滋生微生物的流動相不要存放過久，要及時換新，以免微生物滋生污染色譜柱。
6、色譜柱分析結(jié)束后要及時徹底沖洗。
7、長時間不用的色譜柱要將流動相置換為色譜柱保存的溶劑，并兩端用堵頭封死保存。
8、色譜柱要避免劇烈碰撞、跌落等。
05
流動相流速的選擇
因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不用的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求較佳柱效，應(yīng)使用zui佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1mL/min，對于內(nèi)徑4.0mm柱，流速0.8mL/min為更佳。當(dāng)選用zui佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間（如使用反相柱時，可適當(dāng)增加有機試劑甲醇或乙腈的含量）。
液相色譜柱在色譜分析中起著至關(guān)重要的角色，是樣品分離的核心，正確使用色譜柱才能達到更好的理想的分離效果，提高色譜柱的使用壽命。
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溶劑配置精靈
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倉溫管控精靈
空氣循環(huán)制冷控溫模塊，防止熱空氣進入樣品倉形成冷凝水
譜峰解析精靈
zui小肩縫提取，共流出峰切割，線性范圍拓展
系統(tǒng)一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。
其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部位。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、與柱或保護住、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機控制系統(tǒng)，進行自動化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。
下面就介紹下高效液相色譜使用中的幾個重要環(huán)節(jié)吧。
實驗前的準(zhǔn)備工作
1.過濾流動相。為了保證流動相潔凈，流動相使用前都必須微膜過濾。
2.流動相脫氣。為了避免流動相中氣泡對儀器（氣泡可能會對儀器及相關(guān)設(shè)備的正常使用及壽命產(chǎn)生一定影響）及分析結(jié)果的影響。
3.運行液相泵前盡量先清洗泵柱塞部件。清洗液一般采用10%甲醇溶液，也有采用10%異丙醇溶液
（5%甲醇或異丙醇等有機相溶液能避免微生物污染，但濃度不能太高，高于20%緩沖液可能會導(dǎo)致鹽結(jié)晶析出，碰到酸堿類物質(zhì)可能會有比較強烈的反應(yīng)；另外異丙醇粘度較大，清洗能力較強；也有采用純水清洗的，這樣如果儀器每天使用還行，如果長期不用，為了防止微生物繁殖，純水還得用含有有機相的清洗液置換出去）
沖洗，這是為了保護泵柱塞和密封圈等部件在泵運行時不被結(jié)晶鹽等磨損而導(dǎo)致泵頭漏液。
4.每天運行儀器前先排氣。一般的液相色譜儀都有排氣功能，沒有的可以不接色譜柱開機運行幾分鐘排氣。
5.泵運行時盡量不采用大流量模式（主要是換流動相或排氣泡等，流量盡量設(shè)為3.0ml/min以內(nèi)，這樣更有利于保護泵柱塞桿和密封圈等部件的壽命）。
6.分析前先對色譜系統(tǒng)（整個流路）進行沖洗及平衡，尤其是色譜柱。先用純甲醇沖洗30分鐘，再換10%甲醇水溶液沖洗30分鐘，最后換含緩沖鹽或酸堿類物質(zhì)的流動相平衡30分鐘。色譜柱如果長期沒用，每一步?jīng)_洗、平衡量盡量為色譜柱柱容量20倍以上）。
如果流動相中不含緩沖鹽或酸堿類物質(zhì)，純甲醇沖洗完可直接換為流動相。使用色譜柱前知道或懷疑色譜柱中殘留有或酸堿鹽類物質(zhì)，在用純甲醇沖洗前增加一步10%甲醇水溶液沖洗。
7.如果色譜柱需要控溫（升溫），要先運行泵后再設(shè)柱溫箱溫度。
8.待儀器運行穩(wěn)定后（基線基本走平后，這個是經(jīng)驗值），方可進樣。
樣品前處理
1.樣品濃度不要太大，雜質(zhì)不要太多，否則色譜柱處理起來壓力很大。
2.進樣前樣品一定得先經(jīng)微膜（一般采用0.22um或0.45um微膜）過濾。
實驗過程中注意事項
1.為了避免進樣器殘留影響，進樣前先對進樣器進行清洗（這個不是必須的，但盡量是每進一針樣品或標(biāo)準(zhǔn)品前都清洗進樣器和進樣針，當(dāng)然同一樣品也可以不洗，不同樣品盡量洗），清洗順序為純水、甲醇、流動相。
2.每進一針樣品后要對系統(tǒng)進行一次沖洗、平衡后再進下一針樣品（等度要求不高，梯度要求相對高，主要是沖洗色譜柱中殘留的強保留物質(zhì)）。
實驗完畢的后續(xù)工作
1.做完樣要先清洗進樣器，清洗順序為純水、甲醇。
2.關(guān)閉柱溫箱溫度設(shè)置。
3.沖洗色譜系統(tǒng)及色譜柱。先用10%甲醇水溶液沖洗30分鐘后換為純甲醇沖洗30分鐘，待基線基本走平停泵。如果流動相中不含緩沖鹽或酸堿類物質(zhì)，沖洗時流動相可直接換為純甲醇。色譜柱用完后如果長時間內(nèi)不會再用，純甲醇沖洗量要大于色譜柱柱容量20倍以上的，沖洗后卸下，兩端密封保存。
4.待色譜柱溫度降至接近于室溫時再停泵、關(guān)機（這一點需特別注意，目的是防止溫度過高損壞色譜柱）。
5.關(guān)機前用清洗液清洗柱塞桿。
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