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各種液相色譜檢測器介紹 液相色譜如何操作

時(shí)間:2020-06-29    來源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     
【導(dǎo)讀】紫外吸收檢測器 ultraviolet absorption detector 紫外吸收檢測器 ultraviolet absorption detector 簡稱紫外檢測器(UV),是基于溶質(zhì)分

紫外吸收檢測器 ultraviolet absorption detector

紫外吸收檢測器 ultraviolet absorption detector 簡稱紫外檢測器(UV),是基于溶質(zhì)分子吸收紫外光的原理設(shè)計(jì)的檢測器。因?yàn)榇蟛糠殖R娪袡C(jī)物質(zhì)和部分無機(jī)物質(zhì)都具有紫外吸收性質(zhì),所以該檢測器是液相色譜中應(yīng)用廣泛的檢測器,幾乎所有液相色譜儀都配置了這種檢測器。它不僅有較好的選擇性和較高的靈敏度,而且對環(huán)境溫度、流動(dòng)相組成變化和流速波動(dòng)不太敏感,因此既可用于等度洗脫,也可用于梯度洗脫。其檢測靈敏度在mg/L至mg/L范圍。
可見光檢測器 visible light detector
可見光檢測器 visible light detector 又稱分光光度檢測器,是基于溶質(zhì)分子吸收可見光的原理設(shè)計(jì)的檢測器。能夠直接采用可見光檢測的溶質(zhì)不是很多,而且多數(shù)靈敏度也不高,但采用具有高摩爾吸光系數(shù)的有機(jī)試劑(配位體和螯合劑)作為衍生化試劑進(jìn)行柱前或柱后衍生操作的衍生化光度檢測法是相當(dāng)有用的,特別是在金屬離子配合物液相色譜中的應(yīng)用是相當(dāng)成功的。
低壓梯度 low-pressure gradient
低壓梯度 low-pressure gradient 又稱外梯度,是在低壓狀態(tài)下完成流動(dòng)相強(qiáng)度調(diào)整的梯度裝置。只需一個(gè)高壓泵,與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比,就是在泵前安裝了一個(gè)比例閥,混合就在比例閥中完成。因?yàn)楸壤y是在泵之前,所以是在常壓(低壓)下混合之后再增壓輸送到色譜柱的。
蒸發(fā)光散射檢測器克服常見的HPLC檢測難題
雖然陣法光散射檢測器(Evaportive light Scattering,ELSD)已經(jīng)開發(fā)生產(chǎn)15年,但是對于許多色譜工作者來說,它仍是一個(gè)新產(chǎn)品。第一臺(tái)ELSD是由澳大利亞的Union Carbide研究實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家研制開發(fā)的,并在八十年代初轉(zhuǎn)化為商品,八十年代以激光為光源的第二代ELSD面世。此后,通過不斷設(shè)計(jì)提高了ELSD的操作性能。現(xiàn)在ELSD越來越多的作為通用型檢測器]用于高效液相色譜,超臨界色譜(SFC)和逆流色譜中。ELSD最大的優(yōu)越性在于能檢測不含發(fā)色團(tuán)的化合物,如:碳水化合物、脂類、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性劑、藥物,并在沒有標(biāo)準(zhǔn)品和化合物結(jié)構(gòu)參數(shù)未知的情況下檢測未知化合物 。
ELSD的通用檢測方法消除了常見于傳統(tǒng)HPLC檢測方法中的難點(diǎn),不同于紫外和熒光檢測器,ELSD的響應(yīng)不依賴與樣品的光學(xué)特性,任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品均能被檢測,不受其官能團(tuán)的影響。ELSD
的響應(yīng)值與樣品的質(zhì)量成正比,因而能用于測定樣品的純度或者檢測未知物。示差檢測器(RI)也可以說是一種通用型檢測器,打它靈敏度低,并與梯度脫洗不相容。質(zhì)譜是另一種通用型檢測器,但它的昂貴操作費(fèi)用和復(fù)雜性限制了它的應(yīng)用。
ELSD的獨(dú)特檢測方法,對于它的多種用途和高性能至為關(guān)鍵。ELSD檢測只要分為三個(gè)步驟:(1)用惰性氣體霧化脫洗液(2)流動(dòng)相在加熱管(漂移管)中蒸發(fā)(3)樣品顆粒散射光后得到檢測。
討論:
UV檢測的主要缺點(diǎn)在于紫外不吸收的化合物靈敏度很低。ELSD可以檢測任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品。ELSD的通用性響應(yīng)值使得ELSD響應(yīng)值比UV響應(yīng)值更能代表樣品的質(zhì)量
不同于紫外檢測只能使用不吸收紫外的流動(dòng)相,ELSD能與任何的揮發(fā)性流動(dòng)相相容,不論其光學(xué)特性。您可根據(jù)樣品的溶解度或分離特性選擇流動(dòng)相,例如選擇氯仿和丙酮用于脂類的分離以提高樣品的溶解性。用紫外檢測器定量未知物是困難的,因?yàn)闃悠返淖贤馕罩低痛順悠返馁|(zhì)量的色譜峰的大小無關(guān)。ELSD對幾乎所有的樣品給出一致的響應(yīng)因子。因此可以通過和內(nèi)標(biāo)比較定量未知化合物,此特性對于使用組合化合技術(shù)而合成的系列化合物的定量尤其有用。用組合合成技術(shù)合成的化合物通常是用HPLC聯(lián)合低波長紫外或質(zhì)譜檢測進(jìn)行分析,但是,在缺乏已表面活性劑非常靈敏,并在梯度脫洗下維知結(jié)構(gòu)參數(shù)已知的參照標(biāo)準(zhǔn)品情況下,兩種方法都不能準(zhǔn)確的定量分析此種系列化合物。
熒光檢測
熒光檢測的主要缺點(diǎn)在于只有少數(shù)化合物產(chǎn)生熒光。大多數(shù)的分子不發(fā)熒光,但含有可衍生的官能團(tuán)用于合成能發(fā)熒光的衍生物,例如,鄰苯二甲醛是一種常用熒光基團(tuán)用于柱后衍生氨基酸。雖然熒光檢測很靈敏,但對于常見的樣品分析來說不需要如此高的靈敏度。因?yàn)镋LSD的響應(yīng)不依賴于熒光基團(tuán),所以不需要衍生,因此大大降低了樣品預(yù)處理和分析時(shí)間。
示差檢測:
雖然示差檢測在原理上是通用型檢測器,但是它的靈敏度低,和梯度脫洗不相容,因此它對于HPLC來說不是理想的檢測器。室溫的變化會(huì)影響基線的穩(wěn)定性,大的溶劑前沿峰可能會(huì)掩蓋前期脫洗的色譜峰。因?yàn)镋LSD在檢測前將流動(dòng)相蒸發(fā),所以基線的噪聲和漂移都很小,因此基線穩(wěn)定和樣品檢測的靈敏度高。流動(dòng)相的蒸發(fā)使得ELSD和梯度脫洗相容,因而可提高色譜分離的分辨率和縮短分離時(shí)間。另外ELSD比RI檢測蔗糖靈敏度高和基線穩(wěn)定。
應(yīng)用實(shí)例:
近年來,脂類在生物學(xué)和經(jīng)濟(jì)領(lǐng)域中的重要性正在日益引起廣泛的關(guān)注。脂類的分析方法對于許多研究工作,臨床使用和質(zhì)量控制方面都非常重要。大多數(shù)的脂類分子都缺乏適當(dāng)?shù)陌l(fā)色團(tuán),因此脂類除非通過衍生化,否則不能用紫外檢測。一般但一樣品種含有的各種脂類其極性差異很大,弱項(xiàng)要達(dá)到個(gè)作分的較佳分離和分辨率需要使用梯度脫洗,因而限制了示差檢測器的使用。不同于UV和RI的局限性,ELSD是脂類檢測的有用工具。
碳水化合物不帶有發(fā)色團(tuán),因而不能用UV來檢測。他們通常用氨基柱或者陽離子交換樹脂分離。但是示差檢測器不是很靈敏,而且需要控制溫度來維持基線穩(wěn)定,不能與梯度脫洗相容。ELSD靈敏度高,基線穩(wěn)定,與梯度脫洗相容。
隨著高聚物和表面活性劑在許多行業(yè)中的廣泛應(yīng)用,簡單和可靠的分析方法的尤為重要,他們通常是不含有發(fā)色團(tuán)的復(fù)合分子。此類化合物不帶有適當(dāng)?shù)陌l(fā)色團(tuán)和分離是需要采用梯度脫洗意味著不能采用示差和紫外檢測器。ELSD檢測高聚物和表面活性劑可以保持基線穩(wěn)定。
在科研、臨床和生產(chǎn)的工藝控制上,藥物需要分析評估。目前,隨著日益增長的加速藥品開發(fā)的要求,藥品工作者需要一種開速的鑒定方法來測定帶物的代謝物、雜質(zhì)、降解物和各種天然產(chǎn)物,許多不含有適當(dāng)?shù)陌l(fā)色團(tuán),限制了紫外檢測器的使用。示差比紫外檢測器的靈敏度要低,且不能與梯度脫洗相容,而復(fù)雜的藥品分析常需要梯度脫洗。ELSD的通用檢測能力和梯度相容性使得ELSD是藥物分析的理想工具。因?yàn)镋LSD的響應(yīng)接近于代表產(chǎn)品的質(zhì)量,所以即使在降解產(chǎn)物和雜質(zhì)的性質(zhì)不明確的情況下ELSD的使用為藥物雜質(zhì)分析提供較快速的方法。
結(jié)論: 蒸發(fā)光散射檢測器正日益成為分析碳?xì)浠衔?、表面活性劑、聚合物、脂肪酸和氨基酸、油、和其他難檢樣品的強(qiáng)大工具,多用途的ELSD能檢測任何揮發(fā)相低于流動(dòng)相的樣品,克服了常見于示差和紫外檢測器的缺點(diǎn)。
紫外-可見光(UV-VIS)檢測器
  原理: 基于Lambert-Beer定律,即被測組分對紫外光或可見光具有吸收,且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。
很多有機(jī)分子都具紫外或可見光吸收基團(tuán),有較強(qiáng)的紫外或可見光吸收能力,因此UV-VIS檢測器既有較高的靈敏度,也有很廣泛的應(yīng)用范圍。由于UV-VIS對環(huán)境溫度、流速、流動(dòng)相組成等的變化不是很敏感,所以還能用于梯度淋洗。一般的液相色譜儀都配置有UV-VIS檢測器。
用UV-VIS檢測時(shí),為了得到高的靈敏度,常選擇被測物質(zhì)能產(chǎn)生最大吸收的波長作檢測波長,但為了選擇性或其它目的也可適當(dāng)犧牲靈敏度而選擇吸收稍弱的波長,另外,應(yīng)盡可能選擇在檢測波長下沒有背景吸收的流動(dòng)相。
  二極管陣列檢測器(diode-array detector, DAD): 以光電二極管陣列(或CCD陣列,硅靶攝像管等)作為檢測元件的UV-VIS檢測器(圖8-15)。它可構(gòu)成多通道并行工作,同時(shí)檢測由光柵分光,再入射到陣列式接受器上的全部波長的信號,然后,對二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù),得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長的三維譜圖。與普通UV-VIS檢測器不同的是,普通UV-VIS檢測器是先用單色器分光,只讓特定波長的光進(jìn)入流動(dòng)池。而二極管陣列UV-VIS檢測器是先讓所有波長的光都通過流動(dòng)池,然后通過一系列分光技術(shù),使所有波長的光在接受器上被檢
直接紫外檢測: 所使用的流動(dòng)相為在檢測波長下無紫外吸收的溶劑,檢測器直接測定被測組分的紫外吸收強(qiáng)度。多數(shù)情況下采用直接紫外檢測。
  間接紫外檢測: 使用具有紫外吸收的溶液作流動(dòng)相,間接檢測無紫外吸收的組分。在離子色譜中使用較多,如以具有紫外吸收的鄰苯二甲酸氫鉀溶液作陰離子分離的流動(dòng)相,當(dāng)無紫外吸收的無機(jī)陰離子被洗脫到流動(dòng)相中時(shí),會(huì)使流動(dòng)相的紫外吸收減小。
  柱后衍生化光度檢測: 對于那些可以與顯色劑反應(yīng)生成有色配合物的組分(過渡金屬離子、氨基酸等),可以在組分從色譜柱中洗脫出來之后與合適的顯色劑反應(yīng),在可見光區(qū)檢測生成的有色配合物

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反相液相色譜柱的使用

    反相液相色譜柱具有無與倫比的性能。即使對于非常難分離的堿性化合物,也可獲得出色的峰形,從而改善了這些類型的樣品的柱效和分離度。

 

    反相液相色譜柱使用中的注意事項(xiàng)

    1、新C18柱在使用前,須先用甲醇或乙腈試劑以20倍柱體積低流速?zèng)_洗,作用是使固定相能充分潤濕、碳鏈?zhǔn)嬲箯氐?,使反相液相色譜柱的性能達(dá)到更好狀態(tài)。

    具體操作是,將配制好65%的乙腈/水沖洗后,把色譜柱進(jìn)口端連接在色譜儀上,出口端放空(不可連上檢測器,以免污染了檢測器),以0.1ml/min~0.5ml/min的低流速將色譜柱中的清稀溶液吹干,過20分鐘后再接上檢測器,以1.0ml/min的流速,繼續(xù)沖洗2~8小時(shí);

    2、液相色譜儀檢測分析樣品完畢后,須沖洗色譜柱。尤其是流動(dòng)相中含有酸或鹽時(shí),需將色譜柱中的酸或鹽沖洗干凈,通常建議用10%甲醇水沖洗20倍柱體積;

    3、若反相液相色譜柱處于長期閑置狀態(tài)時(shí),要將色譜柱徹底沖洗,建議沖洗3-4小時(shí)以上,保存在純有機(jī)試劑或高比例的有機(jī)試劑溶液中;

    4、由于C18柱的固定相疏水性較強(qiáng),在使用過程中盡量不要使用高水相條件,若水相比例過高易引起固定相疏水塌陷,引起柱效迅速下降,甚至造成不可逆的負(fù)面影響;由于碳載量高,表現(xiàn)尤為明顯,建議使用過程中水相比例不超過90%;

    5、壓力升高、柱性能下降:通常為色譜柱被污染,對色譜柱進(jìn)行再生處理可恢復(fù)部分柱效;

    6、壓力驟升:通常由鹽析出或篩板堵塞引起,若是鹽析出,用10%甲醇水低流速?zèng)_洗至壓力恢復(fù)即可;若判斷并非鹽析出,以純甲醇或10%甲醇水為流動(dòng)相反沖色譜柱(將色譜柱反接,不接檢測器),若反沖半小時(shí)仍無效果則說明反沖無效,需尋找其他原因。

    在硅膠制造和鍵合技術(shù)方面進(jìn)行了改進(jìn),因此能夠獲得這樣優(yōu)異的性能,并且這些技術(shù)完全由控制。

標(biāo)簽: 液相色譜柱
液相色譜柱 反相液相色譜柱的使用_液相色譜柱 【導(dǎo)讀】色譜柱是化學(xué)實(shí)驗(yàn)中常見、常用的化工儀器之一,正確而有效的使用方法,不僅能夠延長色譜柱的使用壽命,也能確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。1、“保護(hù)柱”的使用保護(hù)柱是很短



    色譜柱是化學(xué)實(shí)驗(yàn)中常見、常用的化工儀器之一,正確而有效的使用方法,不僅能夠延長色譜柱的使用壽命,也能確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

    1、“保護(hù)柱”的使用

    保護(hù)柱是很短的色譜柱,填裝和液相色譜柱相同的填料。正確使用”保護(hù)柱”,可以起到阻攔一些容易損壞液相色譜柱的物質(zhì)的作用。從而達(dá)到延長柱子壽命的效果。相反,如果使用”保護(hù)柱”不當(dāng),可能會(huì)縮短色譜柱的使用壽命。例如,在保護(hù)柱使用過程中,如果污染達(dá)到一定程度而沒有及時(shí)更換,累積的雜物很可能會(huì)沖入色譜柱中,反而會(huì)造成色譜柱損壞。因此,在使用”保護(hù)柱”時(shí),重要的是要知道什幺時(shí)候該換保護(hù)柱。該換的時(shí)候就必須要立即更換。

    2、選擇高品質(zhì)的柱子

    一般認(rèn)為同一廠牌、同一型號的柱子之間的品質(zhì)都相同,對品質(zhì)管理很嚴(yán)格的廠家而言,這說法是成立的。但如果廠家品質(zhì)管理不夠嚴(yán)格,即使是同一批號的新柱子之間的品質(zhì)也有差異。所以,選用柱子時(shí)必須選擇管理嚴(yán)格的高品質(zhì)柱子,我們知道,任何柱子使用過后都會(huì)產(chǎn)生變化。尤其如在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下使用,柱子更易產(chǎn)生變化。因此,應(yīng)盡量選用pH適用范圍大的柱子。在開發(fā)新分析方法時(shí),許多專家建議不要使用舊柱子。因柱子一經(jīng)使用。柱性會(huì)改變;如此一來,使用舊柱子開發(fā)出來的新分析方法,很可能在再使用同廠牌的新柱子分析時(shí)。發(fā)生無法達(dá)到預(yù)定效果的情況??偟恼f。開發(fā)新分析方法時(shí)要使用品質(zhì)好的新柱子;并且一支柱子可以使用在一種分析方法上;則柱子壽命可以延長。

    3、定期沖洗色譜柱

    一般柱子使用一段時(shí)間后總會(huì)有一些雜質(zhì)累積在柱內(nèi),而且這些雜質(zhì)不會(huì)隨著流動(dòng)相出來,會(huì)逐漸影響柱子的品質(zhì)。這些雜質(zhì)在后來的分析譜圖上出現(xiàn)。從而造成出現(xiàn)怪峰、基線不平等現(xiàn)象。簡單的解決方法是用較強(qiáng)的流動(dòng)相沖洗。而且每次分析某一產(chǎn)品完成后沖洗。如果分析時(shí)使用緩沖劑﹐可以用水來取代緩沖劑。先使用有機(jī)和水的混合溶液為流動(dòng)相沖洗緩沖劑。接著再用100%有機(jī)溶劑沖洗。如果直接用100%有機(jī)溶劑沖洗的話,緩沖劑很可能會(huì)沉淀出來,而損壞柱子的品質(zhì)。使用10-20倍柱體積的量來沖洗基本就足夠了。可以將100%有機(jī)溶劑沖洗的條件加在分析實(shí)驗(yàn)程序完畢后,如此一來每天在開機(jī)前都會(huì)用100%機(jī)溶劑沖洗。一般硅膠柱可以反沖洗處理﹐即是在將沖洗前將柱子倒反接后再?zèng)_洗。打算使用反沖洗處理前,可以先參考柱子的保養(yǎng)說明書。所以要真正保護(hù)柱子,使柱子的壽命延長,可以是使用”保護(hù)柱”和定期沖洗柱子。





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