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分光光度計相關(guān)知識 光度計操作規(guī)程

時間：2020-06-21    來源：儀多多儀器網(wǎng)    作者：儀多多商城     
【導(dǎo)讀】分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器，它是一種使用率很高的實驗室儀器。常用于核算、蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。在印染方面，我們可以用分光光度計測量染色時燃料的上染百分率，以及

分光光度計就是利用分光光度法對物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器，它是一種使用率很高的實驗室儀器。常用于核算、蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。在印染方面，我們可以用分光光度計測量染色時燃料的上染百分率，以及整理在織的衣物上助劑的濃度，還可以用于顏色的測量。同時它還廣泛的應(yīng)用于食品檢測、農(nóng)藥的檢測以及工業(yè)上石油的檢測等，紫外可見光光分度在實驗室中的應(yīng)用非常廣泛。

分光光度計的組成

各種型號的可見分光光度計，就其基本結(jié)構(gòu)來說，都是由五個部分組成的，即光源、單色器、洗手池、檢測器以及信號指示系統(tǒng)。如圖所示：

光源→單色器→吸收池→檢測器→信號顯示系統(tǒng)

分光光度計的基本原理

基于物質(zhì)對不同波長的光的選擇性吸收，不同的物質(zhì)都有各自的吸收光譜，當(dāng)光經(jīng)色散后的光譜通過某一溶液時，其中某些波長的光就會被溶液吸收。根據(jù)朗伯-比爾定律，當(dāng)一束平行單色光照射到一定濃度的均勻溶液時，光強的減小程度和入射光的強度，溶液的濃度以及所透過溶液的長度成正比，其公式為：T=I/I0 A=LogI0/I=Kbc

其中：T:透色比 I0：入射光強 A：吸光度 I：頭色光強度 K：吸收系數(shù)，1/mol/com b：液層厚,cm C：溶液的濃度,mol/l

光的吸收定律的使用范圍

光的吸收定律不僅適用于有色溶液，也適用于無色溶液及氣體和固體的非散射均勻體系，不僅適用于可見光的單色光，也適用于紫外和紅外光區(qū)的單色光，但應(yīng)注意，此定律僅適用于單色光和一定范圍的低濃度溶液。溶液濃度過大時，透光性質(zhì)發(fā)生變化，從容使溶液對光的吸收度與溶液濃度不成正比關(guān)系，波長交寬的混合光影響光的互補吸收，也會使測定產(chǎn)生誤差。

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相關(guān)熱詞：

等離子清洗機,反應(yīng)釜,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,高精度溫濕度計,露點儀,高效液相色譜儀價格,霉菌試驗箱,跌落試驗臺,離子色譜儀價格,噪聲計,高壓滅菌器,集菌儀,接地電阻測試儀型號,柱溫箱,旋渦混合儀,電熱套,場強儀萬能材料試驗機價格,洗瓶機,勻漿機,耐候試驗箱,熔融指數(shù)儀,透射電子顯微鏡。



    微量分光光度計能夠快速準(zhǔn)確的定量檢測核酸、蛋白質(zhì)等溶液。具有使用方便、消耗樣品少(僅2μl)、不用預(yù)熱、能迅速清理殘留樣品、不需要比色皿或其它樣品定位裝置、樣品不需要稀釋等特點，常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量，目前已成為眾多實驗室的常規(guī)儀器。

 

 

    工作原理


    超微量分光光度計進(jìn)行濃度測定的原理是根據(jù)朗伯-比爾（Lamber-Beer）定律，A＝K·C·L 式中，A為吸光度；K為吸（消）光系數(shù)；C為溶液的濃度；L為液層厚度。此公式說明：在入射光一定時，溶液的吸光度與溶液的濃度及液層厚度成正比。此式就是光的吸收定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式，又叫朗伯-比爾定律。


    核酸定量


    核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率最大的功能?？梢远繙y定溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA以及RNA含量。這是由于核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵，具有紫外吸收的特性，最大的吸收波長在260nm，吸收波谷在230nm。


    除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。


    蛋白質(zhì)直接定量


    這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。


    比色法蛋白質(zhì)定量


    蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。


    比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。


    與傳統(tǒng)分光光度計相比，超微量分光光度計要求的樣品體積小，不需要比色皿，比色杯清洗方便，只需用干凈的吸水紙將樣品從檢測平臺上擦拭干凈即可。除此之外，實驗過程也更為簡單，不需預(yù)熱，可隨時檢測，檢測結(jié)果顯示吸光度值的同時，程序直接給出濃度值。超微量分光光度計與傳統(tǒng)相比，體積更小，更方便使用。





　　光源部分：
 
　　(1)鎢燈不亮；
 
　　原因：1.鎢燈燈絲燒斷(此種原因幾率zui高)；
 
　　檢查：鎢燈兩端有工作電壓，但燈不亮；取下鎢燈用萬用表電阻檔檢測。
 
　　解決方法：更換新鎢燈；
 
　　原因2. 沒有點燈電壓；
 
　　檢查： 保險絲被熔斷；
 
　　解決方法：更換保險絲，(如更換后再次燒斷則要檢查供電電路)；
 
　　(2)氘燈不亮；
 
　　原因：1氘燈壽命到期(此種原因幾率zui高)；
 
　　檢查：燈絲電壓、陽極電壓均有，燈絲也可能未斷(可看到燈絲發(fā)紅)；
 
　　解決辦法：更換氘燈；
 
　　原因：2.氘燈起輝電路故障；
 
　　檢查：氘燈在起輝的過程中，一般是燈絲先要預(yù)熱數(shù)秒鐘，然后燈的陽極與陰極間才可起輝放電，如果燈在起輝的開始瞬間燈內(nèi)閃動一下或連續(xù)閃動，并且更換新的氘燈后依然如此，有可能是起輝電路有故障，燈電流調(diào)整用的大功率晶體管損壞的幾率zui大。
 
　　解決辦法：需要專業(yè)人士修理；
 
　　二.信號部分：
 
　　(1)沒有任何檢測信號輸出；
 
　　原因：沒有任何光束照射到樣品室內(nèi)；
 
　　檢查：將波長設(shè)定為530nm，狹縫盡量開到zui寬檔位，在黑暗的環(huán)境下用一張白紙放在樣品室光窗出口處，觀察白紙上有無綠光斑影像；
 
　　解決辦法：檢查光源鏡是否轉(zhuǎn)到位？雙光束儀器的切光電機是否轉(zhuǎn)動了(耳朵可以聽見電機轉(zhuǎn)動的聲音)？
 
　　(2)樣品室內(nèi)無任何物品的情況下，全波長范圍內(nèi)基線噪聲大；
 
　　原因：光源鏡位置不正確、石英窗表面被濺射上樣品；
 
　　檢查：觀察光源是否照射到入射狹縫的中央？石英窗上有無污染物？
 
　　解決辦法：重新調(diào)整光源鏡的位置，用乙醇清洗石英窗；
 
　　(3)樣品室內(nèi)無任何物品的情況下，僅僅是紫外區(qū)的基線噪聲大；
 
　　原因：氘燈老化、光學(xué)系統(tǒng)的反光鏡表面劣化、濾光片出現(xiàn)結(jié)晶物；
 
　　檢查：可見區(qū)的基線較為平坦，斷電后打開儀器的單色器及上蓋，肉眼可以觀察到光柵、反光鏡表面有一層白色霧狀物覆蓋在上面；如果光學(xué)系統(tǒng)正常，zui大的可能是氘燈老化，可以通過能量檢查或更換新燈方法加以判斷；
 
　　解決辦法：更換氘燈、用火棉膠粘取鏡面上的污物或用研磨膏研磨濾光片(注意：此種技巧需要有一定維修經(jīng)驗者來實施)；
 
　　(4)樣品室放入空白后做基線記憶，噪聲較大，紫外區(qū)尤甚；
 
　　原因：比色皿表面或內(nèi)壁被污染、使用了玻璃比色皿或空白樣品對紫外光譜的吸收太強烈，使放大器超出了校正范圍；
 
　　檢查：將波長設(shè)定為250nm，先在不放任何物品的狀態(tài)下調(diào)零，然后將空比色皿插入樣品道一側(cè)，此時吸光值應(yīng)小于0.07Abs；如果大于此值，有可能是比色皿不干凈或使用了玻璃比色皿；同樣方法也可判斷空白溶液的吸光值大??；
 
　　解決辦法：清洗比色皿，更換空白溶液；
 
　　(5)吸光值結(jié)果出現(xiàn)負(fù)值(zui常見)；
 
　　原因：沒做空白記憶、樣品的吸光值小于空白參比液；
 
　　檢查：將參比液與樣品液調(diào)換位置便知；
 
　　解決辦法：做空白記憶、調(diào)換參比液或用參比液配置樣品溶液；
 
　　(6)樣品信號重現(xiàn)性不良；
 
　　原因：排除儀器本身的原因外，zui大的可能是樣品溶液不均勻所致；在簡易的單光束儀器中，樣品池架一般為推拉式的，有時重復(fù)推拉不在同一個位置上；
 
　　檢查：更換一種穩(wěn)定的試樣判定；
 
　　解決辦法：采取正確的試樣配置手段；修理推拉式樣品架的定位碰珠；
 
　　(7)做基線掃描或樣品掃描時，基線或信號有一個大的負(fù)脈沖；
 
　　原因：掃描速度設(shè)置得過快，信號在讀取時，誤將濾光片或光源鏡的切換當(dāng)做信號讀取了；
 
　　檢查：改變掃描速度；
 
　　(8)做基線掃描或樣品掃描時，基線或信號有一個長時間段的負(fù)值或滿屏大噪聲；
 
　　原因：濾光片飼服電機“失步”，造成檔位錯位，國產(chǎn)電機尤甚；
 
　　檢查：重新開機有可能回復(fù)，或打開單色器對照波長與濾光片的相對位置來檢查(注意：打開單色器時要保護(hù)檢測器不被強光刺激)；
 
　　解決辦法：更換飼服電機；
 
　　(9)樣品出峰位置不對；
 
　　原因：波長傳動機構(gòu)產(chǎn)生位移；
 
　　檢查：通過氘燈的656.1nm的特征譜線來判斷波長是否準(zhǔn)確；
 
　　解決辦法：對于儀器而言處理手段相對簡單，使用儀器固有的自動校正功能即可；而對于相對簡單的儀器，這種調(diào)整則需要專業(yè)人員來進(jìn)行了；
 
　　(10)信號的分辨率不夠，具體表現(xiàn)是：本應(yīng)疊加在某一大峰上的小峰無法觀察到；
 
　　原因：狹縫設(shè)置過窄而掃描速度過快，造成檢測器響應(yīng)速度跟不上，從而失去應(yīng)測到的信號；按常理，一定的狹縫寬度要對應(yīng)一定范圍的掃描速度；或者狹縫設(shè)置得過寬，使儀器的分辨率下降，將小峰融合在大峰里了。
 
　　檢查：放慢掃描速度看一看或?qū)ⅹM縫設(shè)窄；
 
　　解決辦法：將掃描速度、狹縫寬窄、時間常數(shù)三者擬合成一個zui優(yōu)化的條件；
 
　　(11)當(dāng)儀器波長固定在某個波長下時，吸光值信號上下擺動，特別是測量模式轉(zhuǎn)換為按鍵開關(guān)式的簡易儀器；
 
　　原因：開關(guān)觸點因長期氧化所致造成接觸不良；
 
　　檢查：用手加重力量按琴鍵時，吸光值隨之變化；
 
　　解決辦法：用金屬活化劑清洗按鍵觸點即可；
 
　　(12)儀器零點飄忽不定，主要反映在簡易儀器上；
 
　　原因：在簡易儀器中，零點往往是通過電位器來調(diào)整，這種電位器一般是炭膜電阻制作的，使用久了往往造成接觸不良；
 
　　解決辦法：更換電位器；
 
　　還有一點補充一下,如果是PC連接UV時,同志們一定注意接口板別不小心被擊穿,一定要關(guān)機后拔插.若可見部分穩(wěn)定性不好，有可能是鎢燈的供電電壓不穩(wěn)，一般鎢燈電源是穩(wěn)壓電路
 
　　(13)在使用過程中，出現(xiàn)數(shù)字顯示不能歸零，同時伴有圖線記錄基線位置偏高。
 
　　可能原因：
 
　　①光電倍增等老化，性能降低；
 
　?、谛盘柼幚戆蹇赡馨l(fā)生故障；
 
　?、矍爸梅糯蟀娉霈F(xiàn)故障，引起反饋量增大。
 
　　解決辦法：
 
　?、匍_機通電，先做記錄故障曲線，再與原始記錄的標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，找出異同點，并作一下定性定能分析。然后用一只同型號規(guī)格的新光電倍增管替換機上的光電管，再開機實驗，結(jié)果記錄出來的圖線并沒有什么變化，由此證明光電倍增管沒有老化變質(zhì)。
 
　?、谶M(jìn)一步檢查信號處理板，未發(fā)現(xiàn)信號處理板各元器件損壞，對影響靈敏度有關(guān)的電位器檢測，結(jié)果測得數(shù)據(jù)正常，這說明信號處理板沒有故障。
 
　?、塾?于對以上分析，故障發(fā)生在前置級放大板可能性很大。應(yīng)采用模擬測試對前置放大板進(jìn)行測量，先利用直流穩(wěn)壓電源，把各供電電源加上，使其電路單獨工作，用信 號發(fā)生器發(fā)出的信號加到輸入端。再用示波器接在輸出端測量輸出信號，將輸入信號與輸出信號對比，結(jié)果波形相同，說明電路沒有故障。用相同方法對一個帶驅(qū)動 器的開關(guān)管測量，輸入端加入信號后，用示波器未能測出輸出端信號，判斷開關(guān)管壞，換上同一型號規(guī)格的開關(guān)管，恢復(fù)正常。
 
　　(14)儀器掃描樣品時，顯示一條直線。
 
　　可能原因：軟件出現(xiàn)故障。
 
　　解決辦法：退出操作系統(tǒng)，重新啟動計算機，再次掃描。
 
　　(15)紫外可見分光光度計接通電源后，光源不亮。
 
　　可能原因：
 
　　①光源燈泡已損壞；
 
　?、诒ｋU管燒壞。
 
　　解決辦法：更換氘燈或鎢燈；更換保險管。
 
　　(16)儀器自檢時提示通訊錯誤。
 
　　可能原因：儀器與電腦之間的數(shù)據(jù)線沒有連接好。
 
　　解決辦法：連接好數(shù)據(jù)線，重新打開儀器和軟件，重新自檢。
 
　　(17)自檢時提示波長自檢出錯。
 
　　可能原因：自檢過程中可能打開過儀器樣品室的蓋子。
 
　　解決辦法：關(guān)上儀器樣品室蓋子，重新自檢。
 
　　(18)測試過程中提示能量太低。
 
　　可能原因：
 
　　①光源燈泡使用時間超過壽命期；
 
　?、跇映刂杏胁煌腹獾臇|西擋住了光。
 
　　解決辦法：更換光源燈泡；拿走擋光的物品
 
　　三、使用技巧
 
　?。?）不使用氘燈時如何關(guān)閉氘燈
 
　　當(dāng)連接儀器時，選擇儀器>配置>保養(yǎng)標(biāo)簽，然后點擊氘燈邊上的燈狀態(tài)框，除去復(fù)選標(biāo)記。只要掃描范圍和固定波長測定不在氘燈的范圍之內(nèi)時，氘燈將處于關(guān)閉狀態(tài)。
 
　?。?）如何決定所用的通帶
 
　　選擇測定光譜中zui窄峰的半高度，然后除以10。例如峰的半高度寬是20nm，通帶的優(yōu)選值是2nm。
 
　?。?）初始化剛完成，使用哪條基線
 
　　使用zui后一次存儲的基線。儀器在初始化時不進(jìn)行基線校正。可掃描一次零線，看基線是否完好，如果可以，就使用存在的基線。儀器在出廠時存儲有基線。如果未進(jìn)行過基線校正，則使用的是出廠時的基線。
 
　?。?）如果發(fā)生通訊故障，應(yīng)該檢查哪些項目
 
　?、贆z查在儀器配置屏幕(選擇儀器>配置)中是否選擇了合適的通訊口；
 
　?、跈z查電纜是否正確，牢固地連接
 
　?、蹤z查儀器的電源是否已經(jīng)打開
 
　　（5）燈是如何進(jìn)行準(zhǔn)直的
 
　　實際上燈并不移動。在初始化時，驅(qū)動燈反光鏡的步進(jìn)馬達(dá)連接有傳感器，當(dāng)檢測器發(fā)現(xiàn)能量zui大時，反饋信號到燈室，步進(jìn)馬達(dá)的傳感器自動記憶此時的反光鏡位置。當(dāng)檢查所有的位置后，反光鏡自動返回到記憶的位置。
 
　?。?）紫外區(qū)讀數(shù)漂移的原因
 
　　確認(rèn)氘燈是否點亮。氘燈的使用時間是否超過了預(yù)期的500h壽命，一旦超過，光強減弱，也許需要更新。此外可檢查夾縫寬度的設(shè)置是否太小。
 
　　（7）執(zhí)行了自動調(diào)零后儀器處于什么狀態(tài)
 
　　自動調(diào)零把當(dāng)前固定波長的光度讀數(shù)調(diào)節(jié)為0或者100%，取決于測定的方式。使用自動調(diào)零減去了空白讀數(shù)。通常，在單個固定波長測定時使用自動調(diào)零，如果是多波長測定，應(yīng)該執(zhí)行基線校正。
 
　　（8）為什么執(zhí)行自動調(diào)零后光譜仍然沒有得到有效的校正
 
　　因為自動調(diào)零只校正一個點；要校正光譜范圍，需要進(jìn)行基線校正或精細(xì)的基線校正。精細(xì)的基線校正應(yīng)該定期進(jìn)行，一般每月一次，在樣品室中不必放任何容器。
 
　?。?）基線校正后儀器的狀態(tài)如何？
 
　　基線校使時儀器在制定得波長范圍內(nèi)的光譜讀數(shù)調(diào)整為零。
 
　　（10）為什么基線校正不能正常起作用
 
　　是否樣品室中放了樣品？基線校正時有三種選擇，可確?；€校正的正常。
 
　　①樣品室池架內(nèi)空置(空氣對空氣)。此時校正儀器的基線，特別適合精細(xì)的基線校正
 
　?、跇悠烦刂蟹湃肴軇?，參比側(cè)空置
 
　?、蹣悠泛蛥⒈瘸刂卸挤湃肴軇?br /> 
　　需要確認(rèn)樣品室的門已經(jīng)關(guān)好。雜散光會影響基線的質(zhì)量。此外，在指定的波長范圍內(nèi)溶劑和樣品池的材料匹配。
 
　?。?1）夾縫寬改變以后情況如何
 
　　多數(shù)場合下(紫外/可見區(qū))，設(shè)置夾縫寬也等于設(shè)置了帶寬，換言之設(shè)置了光譜的分辨率。夾縫寬改變，改變了光束的集合尺寸。在使用微量池和流通池時就要權(quán)衡考慮，增加夾縫寬可增加光通量降低噪聲。但是，使用zui大的夾縫寬，噪聲是降低了，付出的代價是分辨率也隨之降低了。
 
　　（12）為什么有時在儀器初始化中會出現(xiàn)氘燈能量或波長正確度故障
 
　　出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能如下。
 
　　①樣品盒參比池中有樣品池
 
　?、谑褂媚承└郊?，如池定位裝置、抽吸單元等，沒有坐落在正確的位置上或未準(zhǔn)直。
 
　?、廴绻惭b了抽吸單元，流通池臟了、空了或沒有準(zhǔn)直。
 
　　④氘燈的使用時間接近或超過預(yù)期的500h壽命，燈的能量降低乃至不能通過能量檢查，并且由于噪聲增加，使波長正確度的檢查也失敗。此時，換新的燈一切問題迎刃而解。


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