色譜柱用久后常出現(xiàn)柱壓升高，柱效降低，峰形畸變，保留時(shí)間改變等變化，如不采取適當(dāng)措施，色譜柱將無(wú)法再使用，縮短色譜柱的使用壽命。在高效液相色譜儀的使用中，保持高效液相色譜柱的柱效、容量和滲透特性，延長(zhǎng)柱子的使用壽命非常重要。
1、流動(dòng)相對(duì)色譜柱的損害因素
顆粒雜質(zhì):目前廣泛使用的柱填料直徑多在10um以下，微小的顆粒雜質(zhì)很容易使柱子發(fā)生堵塞，因此使用的溶劑應(yīng)當(dāng)過(guò)濾，柱子上端接頭應(yīng)當(dāng)裝微孔過(guò)濾片以阻擋顆粒物進(jìn)入柱中。
水溶液中的微生物:以水溶液為流動(dòng)相時(shí)，應(yīng)防止細(xì)菌的生長(zhǎng)，五氯酚、疊氮化鈉、辛酸等能防止細(xì)菌生長(zhǎng)。當(dāng)用水溶液或有機(jī)酸緩沖液保護(hù)柱子時(shí)，一些厭氧霉菌可能在色譜柱中滋生，堵塞固定相顆粒間的空隙。
pH值:對(duì)硅膠基鍵合相填料，水溶液pH值不可超過(guò)2-7.5這一范圍，當(dāng)pH>8時(shí)，硅膠會(huì)釋出
生成絮狀物堵塞柱子，且難以復(fù)原，柱效很快降低，甚至完全失效。
鹽類析出:當(dāng)在流動(dòng)相緩沖液中加入和水混溶的有機(jī)溶劑時(shí)，其中的鹽類溶解度下降，可析出鹽類沉淀，堵塞柱子;加入粘度不同的樣品溶液也可能發(fā)生類似現(xiàn)象。所以緩沖液中鹽的濃度宜低，樣品提取液的組成應(yīng)和流動(dòng)相匹配。
2、樣品對(duì)色譜柱的損害因素
雜質(zhì)堵塞:樣品中的微粒同樣會(huì)使柱子堵塞，樣品也應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾處理。
樣品組分的不可逆吸附:通常被吸附的組分有蛋白質(zhì)、醣等，可以采取加裝保護(hù)柱，或使用適應(yīng)的溶劑反沖來(lái)處理。常用溶劑有四氫呋喃(適用于溶解有機(jī)高聚物和工業(yè)樣品中的焦油)、高濃度的脲或鹽酸胍溶液(使蛋白質(zhì)改性而洗脫)、高離子強(qiáng)度的磷酸鹽緩沖液(pH=7，適合反相柱和離子交換柱，可除去蛋白質(zhì)和醣等)。
樣品組分與固定相反應(yīng):這種反應(yīng)對(duì)NH2柱的影響較嚴(yán)重，NH2易和酐、酮形成希夫(Schiff)縮合而減少活性點(diǎn)，使保留時(shí)間縮短，因此羰基化合物樣品和流動(dòng)相(如丙酮、乙酸乙酯等)不宜使用NH2柱。
活性點(diǎn)被覆蓋:由于固定相吸附樣品中的組成或雜質(zhì)而使活性點(diǎn)被覆蓋，在柱壓升高的同時(shí)保留時(shí)間減少，將樣品過(guò)濾或使用萃取分離柱(對(duì)大分子有機(jī)物如蛋白質(zhì)、白細(xì)胞等)效果較好。
3、色譜柱固定相的化學(xué)變化
色譜柱固定相分解、活性基團(tuán)變性以及鍵合相基團(tuán)脫落會(huì)使保留時(shí)間顯著變化。
1、鍵合相基團(tuán)脫落
絕大多數(shù)鍵合相都是通過(guò)硅氧硅鍵(Si-O-Si)連接在硅基質(zhì)上，形成帶有機(jī)基團(tuán)的固定相Si-O-Si-R(R為、G18H37、C8H17、CnH2n+1)。硅氧硅鍵可在水溶液中水解而斷裂，使鍵合相基團(tuán)脫落，對(duì)C2和NH2柱鍵合相基團(tuán)脫落不可忽視。為減少或防止基團(tuán)脫落，可增加流動(dòng)相的有機(jī)溶劑量，降低離子強(qiáng)度和pH值，對(duì)基團(tuán)已脫落的固定相，可用合適的硅烷試劑再生。
2、固定相分解或活性基團(tuán)變性
例如氰基柱的保留時(shí)間顯著縮短，但鍵合相中C、H、N的百分含量并無(wú)大變化，證明未發(fā)生—CN水解成-COOH反應(yīng)，而是形成了衍生物。在硅上增加烷基可減少水解。
4、高效液相色譜柱的保養(yǎng)
色譜柱在使用一段時(shí)間后，常遇到柱子受污染，柱效下降的問(wèn)題，采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)色譜加以保護(hù)和再生，能夠延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。
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1.進(jìn)樣系統(tǒng)一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。
2.輸液系統(tǒng)該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47～4.4X107Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存錯(cuò)和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、PH值，或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體)都能獲得有效分離。
3.分離系統(tǒng)該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長(zhǎng)度為10～50cm(需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管)，內(nèi)徑為2～5mm，由"優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成).固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹(shù)脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達(dá)1000?)和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過(guò)機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)，或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。因此，這類固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來(lái)。
另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)。基質(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對(duì)縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會(huì)提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C，通過(guò)改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。
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