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反相液相色譜柱使用緩沖液需要注意哪些 液相色譜操作規(guī)程

時間:2020-06-20    來源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     
【導(dǎo)讀】反相液相色譜柱采用高純和高機械強度的硅膠,采用先進(jìn)的鍵合技術(shù)制備而成, 色譜柱表面鍵合率高,覆蓋完全,對堿性和酸性化合物具有良好的峰形。色譜柱柱容量高,



    反相液相色譜柱采用高純和高機械強度的硅膠,采用先進(jìn)的鍵合技術(shù)制備而成, 色譜柱表面鍵合率高,覆蓋完全,對堿性和酸性化合物具有良好的峰形。色譜柱柱容量高,壽命長,是一款具有較高性價比的色譜柱。

    反相液相色譜柱在使用緩沖液的過程中還要注意以下幾點:

    a、避免使用鹽酸鹽,鹽酸鹽對鋼質(zhì)有腐蝕作用;

    b、緩沖液可以要現(xiàn)配現(xiàn)用,往往緩沖液是良好的菌類培養(yǎng)液,隔天或放置長時間實驗時會發(fā)生很多怪現(xiàn)象;

    c、使用緩沖液要及時掌握pH范圍,做到胸中有數(shù);

    d、清洗液路和柱子時,有溫控可加熱到30攝氏度易于沖洗;

    e、長時間用緩沖溶液要注意觀察接頭處有無析出,若有白色鹽類析出,定期用10%硝酸沖洗液路可以避免液路的堵塞;

    f、選擇緩沖液要用可靠的試劑,避免不純的鹽類造成不必要的麻煩;

    過渡流動相是指有機相和水相的組成與分析流動相相同,但是不含緩沖鹽的溶液。






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高效液相色譜儀常見故障解決方法

  高效液相色譜儀是由儲液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、查看器、記錄儀等幾有些構(gòu)成。儲液器中的活動相被高壓泵打入體系,樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入活動相,被活動相載入色譜柱(固定相、內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不一樣的分配系數(shù),在兩相中作相對運動時,經(jīng)過重復(fù)屢次的吸附-解吸的分配進(jìn)程,各組分在移動速度上發(fā)生較大的不一樣,被別離成單個組分順次從柱內(nèi)流出,經(jīng)過查看器時,樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜方式打印出來。

  高效液相色譜儀常見故障解決方法:

  故障1

  活動相內(nèi)有氣泡,封閉泵,翻開泄壓閥,翻開purge鍵,清潔脫氣,氣泡不斷從過濾器冒出,進(jìn)入活動相,不管翻開purge鍵幾回,都無法清除不斷發(fā)生的氣泡。

  因素過濾器長時刻沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi),過濾器內(nèi)部由于霉菌的成長繁衍,構(gòu)成菌團(tuán),阻塞了過濾器,緩沖液難以流暢地經(jīng)過過濾器,空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過濾器進(jìn)入活動相。

  處理過濾器浸泡于5%硝酸溶液中,超聲清潔幾分鐘即可;亦可將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中12~36小時,悄悄震蕩幾回,再將過濾器用純水清潔幾回,翻開泄壓閥,翻開purge鍵,清潔脫氣,如仍有氣泡不斷從過濾器冒出,持續(xù)將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中,如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出,闡明過濾器內(nèi)部的霉菌菌團(tuán)已被硝酸損壞,活動相能夠流暢地經(jīng)過過濾器。翻開泄壓閥,翻開泵,流速調(diào)至1.0~3.0ml/min,純水沖刷過濾器1小時擺布。即可將過濾器清潔潔凈。封閉泄壓閥,純甲醇沖刷半小時即可。

  故障2

  柱壓高因素:緩沖液鹽分如(乙酸銨等)堆積于柱內(nèi);樣品污染堆積。

  處理關(guān)于第一種狀況先用40~50℃的純水,低速正向沖刷柱子,待柱壓逐步降低后,相應(yīng)進(jìn)步流速沖刷,柱壓大幅度降低后,用常溫純水沖刷,之后用純甲醇沖刷柱子30分鐘;關(guān)于第二種狀況,由樣品的堆積導(dǎo)致污染的C18柱,和純水反向沖刷柱子,然后換成甲醇沖刷,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖刷柱子(沖刷時刻的長短由樣品污染的狀況而定),再用換成甲醇沖刷,然后用純水沖刷,最終甲醇沖刷正向沖刷柱子30分鐘以上。

  故障3

  既無壓力指示,又無液體流過[1>;。

  泵密封墊圈磨損;很多氣泡進(jìn)入泵體。

  處理關(guān)于第一種狀況,替換密封墊圈;關(guān)于第二種狀況,在泵作用的一起,用一個50ml的玻璃針筒在泵的出口處協(xié)助抽出空氣。

  故障4

  壓力動搖大,流量不穩(wěn)定.

  因素體系中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物,使得兩者不能密封。

  處理作業(yè)中留意調(diào)查活動相的量,確保不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底,防止吸入空氣,活動相要充沛脫氣[2>;。如為單向閥和閥座之間夾有異物,拆下單向閥,放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清潔.

  故障5

  出峰欠安,峰分叉。

  因素色譜柱被污染;柱頭填料陷落。

  處理關(guān)于第一種狀況,先用純水反向沖刷柱子,然后換成甲醇沖刷,接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖刷柱子(沖刷時刻的長短由樣品污染的狀況而定),再換成甲醇沖刷,然后用純水沖刷,最終甲醇沖刷正向沖刷柱子30分鐘以上。如沖刷后仍然出峰欠安,則考慮第二種狀況。關(guān)于第二種狀況,擰開柱頭,查看柱填料是不是硬結(jié)或陷落。去掉硬結(jié)有些(污染的填料),裝入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用與柱內(nèi)徑一樣的頂端滑潤的不銹鋼桿壓緊,再填平,滴甲醇,再壓緊重復(fù)幾回,直至裝滿填平;。柱頭用甲醇沖刷潔凈,擦凈柱外壁的填料,擰緊柱頭,用純甲醇沖刷30分鐘以上。

標(biāo)簽: 高效液相色譜儀
高效液相色譜儀 高效液相色譜儀常見故障解決方法_高效液相色譜儀 【導(dǎo)讀】發(fā)展歷史:1960年代,由于 氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性,為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì),氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭(Kirkland)、哈

發(fā)展歷史:1960年代,由于

氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性,為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì),氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭(Kirkland)、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀,開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細(xì)的固定相填充色譜柱,提高色譜柱的塔板數(shù),以高壓驅(qū)動流動相,使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內(nèi)完成。
1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實踐》一書,標(biāo)志著高效液相色譜法 (HPLC)正式建立。在此后的時間里,高效液相色譜成為較為常用的分離和檢測手段,在有機化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與檢測、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理論的發(fā)展。
1960年代前,使用的填充粒大于100μm,提高柱效面臨著困境,后來的研究人員便采用微粒固定相來突破著一瓶頸。科克蘭、荷瓦斯制備成功薄殼型固定相,這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼,實現(xiàn)了高速傳質(zhì),為高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展奠定了穩(wěn)固的基礎(chǔ)。隨著填料粒徑的降低,更高的柱效也得以實現(xiàn)。1960年代研制出氣動放大泵、注射泵及低流量往復(fù)式柱塞泵,但后者的脈沖信號很大,難以滿足高效液相色譜的要求。1970年代,往復(fù)式雙柱塞恒流泵,解決了這一問題。1970年代后科克蘭制備出全多孔球形硅膠,平均粒徑只有7μm,具有極好的柱效,并逐漸取代了無定形微粒硅膠。之后又制造出的鍵合固定相使柱的穩(wěn)定性大為提高,多次使用成為可能。1970年后,適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點。1980年后,改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問題,人們越來越認(rèn)識到改變流動相的組成事提高選擇性的關(guān)鍵。
高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)也叫高壓液相色譜(high pressure liquid chromatography)、高速液相色譜(high speed liquid chromatography)、高分離度液相色譜(high resolution liquid chromatography)等。是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上,于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻,小顆粒具有高柱效,但會引起高阻力,需用高壓輸送流動相,故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。
高效液相色譜是目前應(yīng)用較多的色譜分析方法,高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成,其整體組成類似于氣相色譜,但是針對其流動相為液體的特點作出很多調(diào)整。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相) 內(nèi), 由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù), 在兩相中作相對運動時, 經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過程, 各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別, 被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出, 通過檢測器時, 樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。
HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn);進(jìn)樣系統(tǒng)要求進(jìn)樣便利切換嚴(yán)密;由于液體流動相粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣體,為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗,長度也遠(yuǎn)小于氣相色譜柱。HPLC應(yīng)用非常廣泛,幾乎遍及定量定性分析的各個領(lǐng)域。
使用高效液相色譜時,液體待檢測物被注入色譜柱,通過壓力在固定相中移動,由于被測物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同,不同的物質(zhì)順序離開色譜柱,通過檢測器得到不同的峰信號,最后通過分析比對這些信號來判斷待側(cè)物所含有的物質(zhì)。高效液相色譜作為一種重要的分析方法,廣泛的應(yīng)用于化學(xué)和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別,它的特點是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相,適于分析高沸點不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機化合物。
高效液相色譜的特點:
高壓——壓力可達(dá)150~300 kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。
高速——流速為0.1~10.0 mL/min。
高效——塔板數(shù)可達(dá)5000/米。在一根柱中同時分離成份可達(dá)100種。
高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時消耗樣品少。
HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點:
速度快——通常分析一個樣品在15~30 min,有些樣品甚至在5 min內(nèi)即可完成。
分辨率高——可選擇固定相和流動相以達(dá)到較佳分離效果。
靈敏度高——紫外檢測器可達(dá)0.01ng,熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1pg。
色譜柱可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。
樣品量少,容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞,可以收集單一組分或做制備。?
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