液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱，或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團的鍵合相硅膠柱;反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團（ODS）稱為C18柱，其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱，GPC柱，聚合物填料柱等。下面介紹一下反相色譜柱的選擇和使用：
一、反相色譜柱的選擇
1.柱子的PH值使用范圍
反相柱優(yōu)點是固定相穩(wěn)定，應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料，使用時一定要注意流動相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8，流動相的PH值小于2時，會導(dǎo)致鍵合相的水解;當(dāng)PH值大于7時硅膠易溶解;經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況，色譜柱人口處會塌陷。同樣填料各種不同牌號的色譜柱不盡相同。如果流動相PH較高或經(jīng)常使用緩沖液時，建議選擇PH范圍大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH2-9或Zorbax的PH2-11.5的柱子。
2.填料的端基封尾（或稱封口）
把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進行端基封尾，可改善對極性化合物的吸附或拖尾;含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分離;填料穩(wěn)定性好了，組分的保留時間重現(xiàn)性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物，可以選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。
二、液相色譜柱的使用
色譜柱在使用前，可以進行柱的性能測試，并將結(jié)果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是較佳條件），只有這樣，測得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。
1、樣品的前處理
a、可以使用流動相溶解樣品。
b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動相的配制
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）。
b、流動相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果;降低柱壓降，延長泵的使用壽命（可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度）。
d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器，可以使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動相沸點不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實驗無法進行。
f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動相流速的選擇
因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求較佳柱效，可以使用較佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。
當(dāng)選用較佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆姸鹊姆椒ㄒ钥s短分析時間（如使用反相柱時，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量）。
注意：
a.含水流動相可以在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜?？梢约尤氙B氮化鈉，防止細菌生長。
b.流動相要求使用0.45μm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。
c.使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
三.色譜柱的維護
1.色譜柱的平衡
反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的。新柱應(yīng)先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請一定確保您分析樣品所使用的流動相和乙腈/水互溶。每天用足夠的時間以流動相來平衡色譜柱，您就會在處理問題方面獲得最大的"補償"，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長!操作步驟：
a.平衡開始時將流速緩慢地提高，用流動相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低，則需要較長的時間來平衡）
b.如果使用的流動相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動相平衡;分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護柱子。
2.色譜柱的再生
長期使用的色譜柱，往往柱效會下降（柱子的理論塔板數(shù)減低）?？梢詫ιV柱進行再生，在有條件的實驗室應(yīng)使用一個廉價的泵進行柱子的再生。
建議用來沖洗柱子的溶劑體積
色譜柱尺寸柱體積所用溶劑的體積
125-4mm1.6ml30ml
250-4mm3.2ml60ml
250-10mm20ml400ml
選擇再生方法：
極性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色譜填料）的再生：
正庚烷→→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
非極性固定相（如反相色譜填料RP-18，RP-8，CN等）的再生：水→乙腈→（或異丙醇）→乙腈→水
注意：
a.在對NH2改性的色譜柱進行再生時，由于NH2可能以銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱，如果簡單的用有機溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。
3.色譜柱的維護
a.使用預(yù)柱保護分析柱（硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度）
b.大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2-7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍
c.避免流動相組成及極性的劇烈變化
d.流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理
e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應(yīng)在實驗完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中
f.氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕
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當(dāng)色譜柱使用一段時間以后，柱內(nèi)由于各種原因，滯留了一些高沸點組分或氧化物等，除柱效有所下降外，還可能出現(xiàn)基線波動或“鬼峰”。為了去除污染物，使柱效和基線恢復(fù)到原來的狀態(tài)，稱為色譜柱的再生。色譜柱的再生和柱老化有一定區(qū)別和不同，它是柱在使用一段時間柱性能下降，經(jīng)處理后盡量恢復(fù)到原來性能的過程。
A、色譜柱在以下幾種情況必須再生處理
a.使一段時間，柱效明顯下降；
b.柱被污染，特別是在程序升溫時，基線漂移和噪聲超過容忍程度或出現(xiàn)“鬼峰”；
c.柱頭塌陷，柱床短路或斷位(在玻璃柱中容易發(fā)現(xiàn))，而出現(xiàn)尖峰或雙重峰；
d.峰形展寬，保留時間明顯變化；
e.待分離組分和固定相表面非特異性相互作用，引起保留時間較短的峰拖尾或出現(xiàn)雙峰；
B、毛細管柱再生的幾種方法
a.用載氣將色譜柱污染物沖洗出來；
b.將柱頭截去100mm 或更長一些；
c.若使用交聯(lián)的色譜柱，可在儀器上反復(fù)注射溶劑進行沖洗。常用的溶劑依次為丙酮、甲苯、乙醇、氯仿和二氯甲烷，每次可進樣5～10μL；
d.交聯(lián)柱在儀器上沖洗無效時，可把柱拆下來用二氯甲烷或氯仿沖洗，溶劑用量視柱的污染程度而定，一般20mL 左右。
C、色譜柱再生前應(yīng)注意的問題
當(dāng)分析出現(xiàn)問題時，不能只考慮是柱問題，而馬上進行再生。除上述情況外，還應(yīng)考慮樣品處理、進樣技術(shù)、操作有無失誤、數(shù)據(jù)處理參數(shù)有無改變等可能帶來的問題。
a.襯管、預(yù)柱和檢測器被污染也會引起基線不穩(wěn)定、出現(xiàn)“鬼峰”或裂解峰；
b.新的注射墊也會引起基線漂移和出現(xiàn)“鬼峰”；
c.襯管密封欠佳、柱安裝死體積或檢測器固有特性也會引起較早出現(xiàn)峰的拖尾；
d.分析系統(tǒng)發(fā)生變化(如漏氣嚴重)也可能使保留時間突變；
e.峰變寬，除柱效下降外也可能由柱外效應(yīng)引起；
f.進樣量太大也會引起峰變寬、拖尾或保留時間變短；
g.色譜柱長時間樣品過載，保留時間也會變小等。
D、色譜柱再生時應(yīng)注意的幾個問題
1.如前所述和色譜柱老化一樣，不是溫度越高越好，時間越長越好；建議不要使用長時間烘烤的方法，來處理受到污染的色譜柱，因為烘烤時，溫度會把污染的殘留物變成不能溶解的物質(zhì)，再用溶劑清洗也無濟于事；
2.儀器在高靈敏度操作時，如：量程在1×10-11A/mV以下，痕量分析程序升溫過程中，溫度升到大于180℃后，基線明顯漂移是不可避免的；
3.不同類型柱子，再生方法不同；
4.樣品種類、組分、進樣量不同或操作時間長短不同，再生方法也不同；
5.儀器本身條件如：氣源種類、純度、凈化條件、進樣口結(jié)構(gòu)和操作檢測器不同，再生柱方法也有區(qū)別；
6.高分子量組分污染色譜柱后，高溫再生時間長會導(dǎo)致固定相的老化；使用交聯(lián)或鍵合柱可以用溶劑漂洗再生，漂洗溶劑流動方向一定要從柱出口注入。應(yīng)該注意，毛細管柱交聯(lián)鍵合率通常不到90%，因此會漂洗掉未化學(xué)結(jié)合的液相部分，所以保留時間和分離狀態(tài)會有所變化；
7.對于難揮發(fā)物，碳化物是不能通過再生除去，對于填充柱可以使用帶襯管氣化室進樣器，對于毛細管可通過把柱入口切去30～50cm的方法除去污物段。有條件的可以使用預(yù)柱，把不揮發(fā)的有機物、無機物和顆粒材料阻留在預(yù)柱中，需要時更換預(yù)柱；
8.在某些情況下，色譜柱要在溫度極限附近使用，這時基線漂移和大噪聲已不可避免，柱的再生要求只能視情況而定；
9.不是所有色譜柱通過再生均能恢復(fù)原來性能。
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