詳述Pcr儀的四大分類及常見(jiàn)問(wèn)題解答
PCR就是利用DNA聚合酶對(duì)特定基因做體外或試管內(nèi)In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來(lái)的一百億至一千億倍。根據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀四類。
普通PCR儀
一般把一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀，稱之為普通PCR儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運(yùn)行。主要是用作簡(jiǎn)單的，對(duì)目的基因退火溫度的擴(kuò)增。
主要應(yīng)用于科研、教學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)、檢疫等。
梯度PCR儀
一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（通常12種溫度梯度）的稱之為梯度PCR儀。因?yàn)楸粩U(kuò)增的不同的DNA片段其zui適合的退火溫度不同，通過(guò)設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增就可以篩選出表達(dá)量高的zui適合退火溫度進(jìn)行有效的擴(kuò)增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣既節(jié)約時(shí)間，也節(jié)約經(jīng)費(fèi)。在不設(shè)置梯度的情況下亦可當(dāng)做普通的PCR用。正真的梯度，是每一排管都有的加熱控溫探頭，2009年為止只有美國(guó)ABI公司可以做到。其他的都是從兩頭的熱傳遞來(lái)設(shè)計(jì)控溫。
梯度PCR儀多應(yīng)用于科研、教學(xué)機(jī)構(gòu)。
原位PCR儀
（有些品牌的PCR儀具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能，通過(guò)替換模塊進(jìn)行多用途開展實(shí)驗(yàn)工作）
是用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴(kuò)增儀。如病原基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等?？杀３旨?xì)胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置進(jìn)行基因擴(kuò)增。不但可以檢測(cè)到靶DNA，還能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置。于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過(guò)程及病理的轉(zhuǎn)變有著重大的實(shí)用價(jià)值。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀
在普通PCR儀設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上增加熒光信號(hào)激發(fā)和采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，形成了具有熒光定量PCR功能的儀器。其PCR擴(kuò)增原理和普通PCR擴(kuò)增原理相同，在PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過(guò)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。
熒光定量PCR儀有單通道，雙通道和多通道之分。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時(shí)候，選用單通道；有多種熒光標(biāo)記的時(shí)候使用多通道。單通道也可以檢測(cè)多熒光的標(biāo)記和目的基因表達(dá)產(chǎn)物，因?yàn)橐淮沃荒軝z測(cè)一種目的基因的擴(kuò)增量，需多次擴(kuò)增才能檢測(cè)完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR，實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)多種目的基因的功能。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。
PCR儀常見(jiàn)問(wèn)題及回答
1. cDNA產(chǎn)量的很低
可能的原因：
*RNA模板質(zhì)量低
*對(duì)mRNA濃度估計(jì)過(guò)高
*反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足
*同位素磷32過(guò)期
*反應(yīng)體積過(guò)大，不應(yīng)*過(guò)50μl
2. 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒(méi)有條帶或條帶很淺
*zui常見(jiàn)的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系
*與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)
*建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照RNA
**鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要*過(guò)1/10
*建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物（GSP）用于*鏈合成。由于RNA模板存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無(wú)法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無(wú)法從此引物進(jìn)行有效延伸。
*目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：
a. 將*鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。
b. 使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行*鏈反應(yīng)。
3. 產(chǎn)生非特異性條帶
*用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。
*在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。
*由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。
電泳技術(shù)是分子生物學(xué)研究不可缺少的重要分析手段。電泳分為自由界面電泳和區(qū)帶電泳兩大類：
1、自由界面電泳不需支持物，如等電聚焦電泳、等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等，這類電泳目前已很少使用。
2、區(qū)帶電泳則需用各種類型的物質(zhì)作為支持物，常用的支持物有濾紙、醋酸纖維薄膜、非凝膠性支持物、凝膠性支持物及硅膠-G薄層等，分子生物學(xué)領(lǐng)域中常用的是瓊脂糖凝膠電泳。
下面簡(jiǎn)單介紹其使用方法：
1．首先用導(dǎo)線將電泳槽的兩個(gè)電極與電泳儀的直流輸出端聯(lián)接，注意極性不要接反。
2．電泳儀電源開關(guān)調(diào)至關(guān)的位置，電壓旋鈕轉(zhuǎn)到最小，根據(jù)工作需要選擇穩(wěn)壓穩(wěn)流方式及電壓電流范圍。
3．接通電源，緩緩旋轉(zhuǎn)電壓調(diào)節(jié)鈕直到達(dá)到的所需電壓為止，設(shè)定電泳終止時(shí)間，此時(shí)電泳即開始進(jìn)行。
4．工作完畢后，應(yīng)將各旋鈕、開關(guān)旋至零位或關(guān)閉狀態(tài)，并撥出電泳插頭。
常用的電泳分析方法主要有：
醋酸纖維素薄膜電泳、凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳、毛細(xì)管電泳
電泳儀使用方法
1、首先用導(dǎo)線將電泳槽的兩個(gè)電極與電泳儀的直流輸出端聯(lián)接，注意極性不要接反。
2、電泳儀電源開關(guān)調(diào)至關(guān)的位置，電壓旋鈕轉(zhuǎn)到最小，根據(jù)工作需要選擇穩(wěn)壓穩(wěn)流方式及電壓電流范圍。
3、接通電源，緩緩旋轉(zhuǎn)電壓調(diào)節(jié)旋鈕直到達(dá)到的所需電壓為止，設(shè)定電泳終止時(shí)間，此時(shí)電泳即開始進(jìn)行。
4、工作完畢后，應(yīng)將各旋鈕、開關(guān)旋至零位或關(guān)閉狀態(tài)，并撥出電泳插頭。
電泳儀分類
根據(jù)電泳儀原理、電泳儀功能、電泳儀的使用方法、電泳儀的用途不同可以為：
瓊脂糖凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、醋酸纖維薄膜電泳、高效毛細(xì)管電泳、瓊脂糖電泳、SDS-PAGE凝膠電泳、蛋白質(zhì)電泳、血清蛋白電泳、dna電泳、血紅蛋白電泳、蛋白質(zhì)雙向電泳、免疫電泳、等電聚焦電泳、單細(xì)胞凝膠電泳、蛋白質(zhì)凝膠電泳、質(zhì)粒電泳、對(duì)流免疫電泳、變性電泳等。
PCR的工作機(jī)制
PCR由一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，包含前、中、后三個(gè)階段。重要的化學(xué)變化是熱循環(huán)期間的產(chǎn)物合成。每次循環(huán)后產(chǎn)物、模板、聚合酶、引物和脫氧核苷酸的余量都會(huì)改變，處于連續(xù)的不穩(wěn)定狀態(tài)。所有的循環(huán)都是從模板和先前產(chǎn)物的變性開始。當(dāng)溫度較低時(shí)，引物退火到模板上。
早先若干循環(huán)的退火步驟要求引物尋找正確的染色體模板作為它們的目標(biāo)。在中期的循環(huán)中，先前合成的產(chǎn)物優(yōu)先成為模板。最后幾個(gè)循環(huán)中，增擴(kuò)后的高濃度產(chǎn)物互相雜交，由此阻止與引物的雜交。
引物退火后，Taq DNA聚合酶把自己定位到引物和模板綜合體上，提取介質(zhì)中的自由dNTPs然后沿著模板延伸。從本質(zhì)上講，引物和模板的任何反應(yīng)都會(huì)造成產(chǎn)物擴(kuò)展，它們的特異性在最初的幾個(gè)循環(huán)中可能很難控制，得到非特異性產(chǎn)物的摩爾量超過(guò)在模板上正確退火位置的量。PCR反應(yīng)特異性的可靠度依賴于2個(gè)引物必須定位到互補(bǔ)的DNA鏈上。進(jìn)一步講，退火溫度和Mg2+離子的濃度影響引物穩(wěn)定的雜交到模板上，雜交位置間距應(yīng)小于10kb。
相比之下，增擴(kuò)階段的大部分循環(huán)里，模板被很好的與先前增擴(kuò)的片段區(qū)分開。這些片段的數(shù)量取決于早先若干個(gè)循環(huán)的嚴(yán)密性。甄選同源性引物的退火位置是較簡(jiǎn)單的，增擴(kuò)期間由染色體DNA貢獻(xiàn)的有效的模板數(shù)量只是可以忽略一小部分。甄選的復(fù)雜性被超量由引物從互補(bǔ)位點(diǎn)新增擴(kuò)的片段所降低。
PCR的化學(xué)計(jì)量
熱力學(xué)方面的影響對(duì)PCR來(lái)講是試劑濃度和模板間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。在起先的循環(huán)中PCR試劑的摩爾比率是最高的，隨著PCR產(chǎn)物的增加而降低。令人驚訝的是這種減低是由增擴(kuò)的目標(biāo)分子的增加引起的而不是由于試劑的消耗。最初剩余的引物和脫氧核苷酸與模板的比率是固定的，反應(yīng)結(jié)束后，dNTP的濃度下降超過(guò)1倍，引物任然剩余95%，Taq DNA聚合酶沒(méi)有變化。增擴(kuò)千萬(wàn)倍目標(biāo)分子后，模板分子遠(yuǎn)多于酶分子。當(dāng)產(chǎn)物增加后，酶全部被占用了，引物和模板的比率減低，推動(dòng)自身退火。當(dāng)自身退火的數(shù)量增加或酶的總量有限時(shí)，反應(yīng)處于飽狀態(tài)并停止指數(shù)級(jí)的增長(zhǎng)。增擴(kuò)階段是自我受限的。這個(gè)階段之后，熱循環(huán)轉(zhuǎn)向未在最初幾個(gè)循環(huán)中被選擇的欺騙性的目標(biāo)增擴(kuò)，盡管能夠通過(guò)提高開始時(shí)Taq DNA聚合酶和引物的含量來(lái)維持高試劑比率，但這種修改很可能引起丟失特異性因?yàn)橐飼?huì)胡亂雜交，出現(xiàn)額外的條帶和斑點(diǎn)。
熱啟動(dòng)（hot start）PCR
用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR對(duì)提高PCR特異性尤為有效。 盡管Taq DNA聚合酶的較佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在PCR配制過(guò)程中，熱循環(huán)剛開始，以及保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡(jiǎn)單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，無(wú)法完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。熱啟動(dòng)通過(guò)抑制DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。方法包括延緩加入Taq DNA聚合酶，在反應(yīng)體系達(dá)到90度時(shí)，暫停并保持溫度在70度以上。手工加入聚合酶，這個(gè)方法過(guò)于煩瑣， 尤其是對(duì)高通量應(yīng)用容易造成污染。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分如鎂離子、酶、模板、緩沖液包裹起來(lái)，物理地分隔開。熱循環(huán)開始后，因蠟熔化而把各種成分釋放出來(lái)并混合在一起。蠟防護(hù)層法與手動(dòng)熱啟動(dòng)法一樣比較煩瑣，易受污染，不適用于高通量應(yīng)用。
還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗體抑制失活，當(dāng)變性溫度超過(guò)70度時(shí)，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。
Booster PCR
整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程中引物前后擔(dān)任2種功能，篩選探針和增擴(kuò)引導(dǎo)。在最初的幾個(gè)熱循環(huán)期間，每個(gè)引物作為探針獨(dú)立地活動(dòng)，篩選所有目標(biāo)。如果一對(duì)引物與目標(biāo)雜交，方向和位置都正確，就意味著目標(biāo)選擇的工作完成了。接下來(lái)在以后的循環(huán)中這對(duì)引物引導(dǎo)增擴(kuò)反應(yīng)。
增擴(kuò)低濃度的模板（等于或小于100個(gè)模板）比如單個(gè)細(xì)胞，石蠟化的組織有不同的特點(diǎn)。篩選階段相對(duì)于模板而言要有更多剩余的試劑。稀釋的模板造成難以篩選，因?yàn)橐锖湍０逑嘤龊皖l率被大大的降低了。這種情況更有可能引起引物之間形成二聚體。Booster PCR是解決這個(gè)問(wèn)題的方法。在此步驟中，第一個(gè)循環(huán)階段使用稀釋后的引物和模板取得固定的引物/模板比例，大約在107:1。以確保開始擴(kuò)增時(shí)的準(zhǔn)確性，在增擴(kuò)階段提高引物的濃度到正常水品。
嵌套的引物
如果增擴(kuò)出的DNA序列嵌套存在于引物退火位置之間，從大范圍看增擴(kuò)出的目標(biāo)是同源的。引物雜交的嚴(yán)密性在最初若干個(gè)循環(huán)里是寬松的，允許較高的錯(cuò)配偏差。這個(gè)效果能通過(guò)低于計(jì)算得到引物退火溫度來(lái)達(dá)到。第二步選擇明確的產(chǎn)物，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)剡x擇一條已知染色體片段用來(lái)增擴(kuò)。簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō)就是設(shè)計(jì)兩對(duì)引物, 一對(duì)是長(zhǎng)的，另一對(duì)短的是包含在長(zhǎng)引物內(nèi)的，用長(zhǎng)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物作為第二次擴(kuò)增的模板，這樣可以增加產(chǎn)物的量而且可以減少非特異性帶和錯(cuò)配的情況.
假陰性
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因?yàn)槊傅幕钚詥适Щ虿粔蚨鴮?dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)PCR時(shí)忘了加Taq酶或電泳時(shí)忘了加溴化乙錠。
引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物使用過(guò)程中應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等。
假陽(yáng)性
引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及進(jìn)樣槍頭均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。
出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次，是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶的量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：①必要時(shí)，重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶的量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸，也叫兩步法)。
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶的量過(guò)大或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：①減少酶的量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃 度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)
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