定量分析和定性分析是分光光度計的兩大主要功能,特別是定量分析。其它的分析都應該是從這兩大種功能中發(fā)展出來的。下面來詳細介紹介紹:
(1)定量分析
根據(jù)瑯伯-比爾定律,樣品的濃度和吸光度是成正比關系的,濃度越大,吸收值越高,所以分光光度計用的較多的還是定量分析,定量分析的種類有很多,這里介紹常用的幾種定量分析方法:
A、絕對法:絕對法是紫外可見分光光度計諸多分析方法中使用較多的一種方法。這是一種以瑯伯-比爾定律A=εbC為基礎的分析方法,某一物質在一定波長下ε值是一個常數(shù),石英比色皿的光程是已知的,也是一個常數(shù)。因此,可用紫外可見分光光度計在λmax波長處,測定樣品溶液的吸光度值A。然后,根據(jù)瑯伯比爾定律求出C=A/εb,則可求出該樣品溶液的含量或濃度。
B、標準法:在選定的波長處,在相同的測試條件下,分別測試標準樣品溶液C標和被測試樣品溶液C樣的吸光度A標和A樣。然后,按下式求得樣品溶液的濃度或含量。
C樣=A樣/A標×C標
C、標準曲線法
紫外可見分光光度計常用的定量分析方法是標準曲線法。即先用標準物質配制一定濃度的溶液,再將該溶液配制成一系列的標準溶液。在一定波長下,測試每個標準溶液的吸光度,以吸光度值為縱坐標,標準溶液對應得濃度為橫坐標,繪制標準曲線。最后,將樣品溶液按標準曲線繪制程序測得吸光度值,在標準曲線上查出樣品溶液對應的濃度或含量。
A、其它分析方法
除上述幾個分析方法外經(jīng)常使用的分析方法外,還有比吸收系數(shù)法、最小二乘法、解聯(lián)立方程法和示差分光光度法。
(2)定性分析
如果未知物的紫外吸收光譜的最大吸收峰波長λmax、最小吸收峰波長λmin、最大摩爾吸光系數(shù)εmax,以及吸收峰的數(shù)目、位置、拐點與標準光譜數(shù)據(jù)完全一致,就可以認為是同一種化合物。定性分析的主要目的是知道分析樣品中是什么物質。
雙光束紫外-可見分光光度計(以下簡稱儀器),系指從單色器發(fā)出的單色光經(jīng)光束開關(斬光器)分成為樣品和參比兩條光束結構的儀器。
它能消除光源不穩(wěn)和放大器增益變化的影響,并能自動記錄和掃描物質的吸收光譜圖。
儀器在開機后通常會做一些自檢,但仍應按本規(guī)程進行檢定。儀器的波長范圍包括195~800nm,狹縫為0.1~5nm可調(diào)。
工作原理
紫外可見分光光度法是利用物質分子對紫外可見光譜區(qū)的輻射的吸收來進行分析的一種儀器分析方法。
這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價電子能級的躍遷,它廣泛用于無機和有機物質的定性和定量分析。
朗伯一一比耳定律(Lambet-Beer)是光吸收的基本定律,俗稱光吸收定律,是分光光度法定量分析的依據(jù)和基礎。
當入射光波長一定時,溶液的吸光度是吸光物質的濃度c及吸收介質厚度(吸收光程)的函數(shù)。
其常用表達式如下(式中ε為系數(shù)):
A=ε·c·l
紫外見分光光度計是基于紫外可見分光光度法的原理工作的常規(guī)分析儀器。根據(jù)光路設計的不同,紫外可見分光光度計可以分為單光束分光光度計、雙光束分光光度計和雙波長分光光度計。
制定依據(jù)
本規(guī)程主要參照國家計量檢定規(guī)程《JJG178-2007紫外、可見、近紅外分光光度計》、《JJF1641-2017紫外可見分光光度計型式評價大綱》及《中國藥典》2015年版四部指導通則“0401紫外-可見分光光度法”擬定。
項目及技術要求
波長準確度≤±1.0nm(紫外光區(qū)),≤±2.0nm(500nm附近);
波長重復性≤0.5nm。
基線平直度≤0.01吸光度。
0%線噪聲≤0.1%,100%線噪聲≤0.5%.
吸光度準確度應符合規(guī)定。
雜散光<0.8%。
光譜帶寬≤標示帶寬±20%。
吸收池配對誤差≤0.5%。
檢測結果處理
自檢結果全部符合技術要求者,即為合格,可以使用。若檢測結果不符合規(guī)定,應重新調(diào)試儀器再進行自檢,符合規(guī)定后方可使用。