當(dāng)色譜柱使用一段時間以后,柱內(nèi)由于各種原因,滯留了一些高沸點組分或氧化物等,除柱效有所下降外,還可能出現(xiàn)基線波動或“鬼峰”。為了去除污染物,使柱效和基線恢復(fù)到原來的狀態(tài),稱為色譜柱的再生。色譜柱的再生和柱老化有一定區(qū)別和不同,它是柱在使用一段時間柱性能下降,經(jīng)處理后盡量恢復(fù)到原來性能的過程?! 、色譜柱在以下幾種情況必須再生處理 a.使一段時間,柱效明顯下降; b.柱被污染,特別是在程序升溫時,基線漂移和噪聲超過容忍程度或出現(xiàn)“鬼峰”; c.柱頭塌陷,柱床短路或斷位(在玻璃柱中容易發(fā)現(xiàn)),而出現(xiàn)尖峰或雙重峰; d.峰形展寬,保留時間明顯變化; e.待分離組分和固定相表面非特異性相互作用,引起保留時間較短的峰拖尾或出現(xiàn)雙峰; B、毛細(xì)管柱再生的幾種方法 a.用載氣將色譜柱污染物沖洗出來; b.將柱頭截去100mm 或更長一些; c.若使用交聯(lián)的色譜柱,可在儀器上反復(fù)注射溶劑進(jìn)行沖洗。常用的溶劑依次為丙酮、甲苯、乙醇、氯仿和二氯甲烷,每次可進(jìn)樣5~10μL; d.交聯(lián)柱在儀器上沖洗無效時,可把柱拆下來用二氯甲烷或氯仿沖洗,溶劑用量視柱的污染程度而定,一般20mL 左右。 C、色譜柱再生前應(yīng)注意的問題 當(dāng)分析出現(xiàn)問題時,不能只考慮是柱問題,而馬上進(jìn)行再生。除上述情況外,還應(yīng)考慮樣品處理、進(jìn)樣技術(shù)、操作有無失誤、數(shù)據(jù)處理參數(shù)有無改變等可能帶來的問題?! .襯管、預(yù)柱和檢測器被污染也會引起基線不穩(wěn)定、出現(xiàn)“鬼峰”或裂解峰; b.新的注射墊也會引起基線漂移和出現(xiàn)“鬼峰”; c.襯管密封欠佳、柱安裝死體積或檢測器固有特性也會引起較早出現(xiàn)峰的拖尾; d.分析系統(tǒng)發(fā)生變化(如漏氣嚴(yán)重)也可能使保留時間突變; e.峰變寬,除柱效下降外也可能由柱外效應(yīng)引起; f.進(jìn)樣量太大也會引起峰變寬、拖尾或保留時間變短; g.色譜柱長時間樣品過載,保留時間也會變小等?! 、色譜柱再生時應(yīng)注意的幾個問題 1.如前所述和色譜柱老化一樣,不是溫度越高越好,時間越長越好;建議不要使用長時間烘烤的方法,來處理受到污染的色譜柱,因為烘烤時,溫度會把污染的殘留物變成不能溶解的物質(zhì),再用溶劑清洗也無濟(jì)于事; 2.儀器在高靈敏度操作時,如:量程在1×10-11A/mV以下,痕量分析程序升溫過程中,溫度升到大于180℃后,基線明顯漂移是不可避免的; 3.不同類型柱子,再生方法不同; 4.樣品種類、組分、進(jìn)樣量不同或操作時間長短不同,再生方法也不同; 5.儀器本身條件如:氣源種類、純度、凈化條件、進(jìn)樣口結(jié)構(gòu)和操作檢測器不同,再生柱方法也有區(qū)別; 6.高分子量組分污染色譜柱后,高溫再生時間長會導(dǎo)致固定相的老化;使用交聯(lián)或鍵合柱可以用溶劑漂洗再生,漂洗溶劑流動方向一定要從柱出口注入。應(yīng)該注意,毛細(xì)管柱交聯(lián)鍵合率通常不到90%,因此會漂洗掉未化學(xué)結(jié)合的液相部分,所以保留時間和分離狀態(tài)會有所變化; 7.對于難揮發(fā)物,碳化物是不能通過再生除去,對于填充柱可以使用帶襯管氣化室進(jìn)樣器,對于毛細(xì)管可通過把柱入口切去30~50cm的方法除去污物段。有條件的可以使用預(yù)柱,把不揮發(fā)的有機物、無機物和顆粒材料阻留在預(yù)柱中,需要時更換預(yù)柱; 8.在某些情況下,色譜柱要在溫度極限附近使用,這時基線漂移和大噪聲已不可避免,柱的再生要求只能視情況而定; 9.不是所有色譜柱通過再生均能恢復(fù)原來性能。
反相液相色譜柱具有無與倫比的性能。即使對于非常難分離的堿性化合物,也可獲得出色的峰形,從而改善了這些類型的樣品的柱效和分離度。
反相液相色譜柱使用中的注意事項
1、新C18柱在使用前,須先用甲醇或乙腈試劑以20倍柱體積低流速沖洗,作用是使固定相能充分潤濕、碳鏈?zhǔn)嬲箯氐祝狗聪嘁合嗌V柱的性能達(dá)到更好狀態(tài)。
具體操作是,將配制好65%的乙腈/水沖洗后,把色譜柱進(jìn)口端連接在色譜儀上,出口端放空(不可連上檢測器,以免污染了檢測器),以0.1ml/min~0.5ml/min的低流速將色譜柱中的清稀溶液吹干,過20分鐘后再接上檢測器,以1.0ml/min的流速,繼續(xù)沖洗2~8小時;
2、液相色譜儀檢測分析樣品完畢后,須沖洗色譜柱。尤其是流動相中含有酸或鹽時,需將色譜柱中的酸或鹽沖洗干凈,通常建議用10%甲醇水沖洗20倍柱體積;
3、若反相液相色譜柱處于長期閑置狀態(tài)時,要將色譜柱徹底沖洗,建議沖洗3-4小時以上,保存在純有機試劑或高比例的有機試劑溶液中;
4、由于C18柱的固定相疏水性較強,在使用過程中盡量不要使用高水相條件,若水相比例過高易引起固定相疏水塌陷,引起柱效迅速下降,甚至造成不可逆的負(fù)面影響;由于碳載量高,表現(xiàn)尤為明顯,建議使用過程中水相比例不超過90%;
5、壓力升高、柱性能下降:通常為色譜柱被污染,對色譜柱進(jìn)行再生處理可恢復(fù)部分柱效;
6、壓力驟升:通常由鹽析出或篩板堵塞引起,若是鹽析出,用10%甲醇水低流速沖洗至壓力恢復(fù)即可;若判斷并非鹽析出,以純甲醇或10%甲醇水為流動相反沖色譜柱(將色譜柱反接,不接檢測器),若反沖半小時仍無效果則說明反沖無效,需尋找其他原因。
在硅膠制造和鍵合技術(shù)方面進(jìn)行了改進(jìn),因此能夠獲得這樣優(yōu)異的性能,并且這些技術(shù)完全由控制。