島津LC-10AT液相色譜儀使用流程與規(guī)范
島津LC-10AT液相色譜儀，是一款高性價(jià)比高市場占有率的HPLC，下文為該款機(jī)型的使用流程的規(guī)范：1．目的
規(guī)范島津LC-10AT型液相色譜儀的使用。
2．范圍
適用于島津LC-10AT型液相色譜儀的使用。
3．職責(zé)
質(zhì)檢員對本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。
4．規(guī)程
4.1系統(tǒng)組成：本系統(tǒng)由2個LC-10ATvp溶劑輸送泵（分主/A泵和副/B泵）、Rheodyne7725i手動進(jìn)樣閥、SPD-10Avp紫外-可見檢測器、N2000色譜數(shù)據(jù)工作站和電腦等組成，另外還包括打印機(jī)、不間斷電源等輔助設(shè)備。
4.2準(zhǔn)備
4.2.1準(zhǔn)備所需的流動相，用合適的0.45μm濾膜過濾，超聲脫氣20min。
4.2.2根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的洗脫柱（注意方向）和定量環(huán)。
4.2.3配制樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液（也可在平衡系統(tǒng)時(shí)配制），用合適的0.45μm濾膜過濾。
4.2.4檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是否連接正常。
4.3開機(jī)：接通電源，依次開啟不間斷電源、B泵、A泵、檢測器，待泵和檢測器自檢結(jié)束后，打開打印機(jī)、電腦顯示器、主機(jī)，zui后打開色譜工作站。
4.4參數(shù)設(shè)定
4.4.1波長設(shè)定：在檢測器顯示初始屏幕時(shí)，按[func]鍵，用數(shù)字鍵輸入所需波長值，按[Enter]鍵確認(rèn)。按[CE]鍵退出到初始屏幕。
4.4.2流速設(shè)定：在A泵顯示初始屏幕時(shí)，按[func]鍵，用數(shù)字鍵輸入所需的流速（柱在線時(shí)流速一般不超過1ml/min），按[Enter]鍵確認(rèn)。按[CE]鍵退出。
4.4.3流動相比例設(shè)定：在A泵顯示初始屏幕時(shí)，按[conc]鍵，用數(shù)字鍵輸入流動相B的濃度百分?jǐn)?shù)，按[Enter]鍵確認(rèn)。按[CE]鍵退出。
4.4.4梯度設(shè)定
4.4.4.1在A泵顯示初始屏幕時(shí)，按[edit]鍵，[Enter]鍵；
4.4.4.2用數(shù)字鍵輸入時(shí)間，按[Enter]鍵，重復(fù)按[func]鍵選擇所需功能（FLOW設(shè)定流速，BCNC設(shè)定流動相B的濃度），按[Enter]鍵，用數(shù)字鍵輸入設(shè)定值，按[Enter]鍵；
4.4.4.3重復(fù)上一步設(shè)定其它時(shí)間步驟；
4.4.4.4用數(shù)字鍵輸入停止時(shí)間，重復(fù)按[func]鍵直至屏幕顯示STOP，按[Enter]鍵。按[CE]鍵退出。
4.5更換流動相并排氣泡
4.5.1將A/B管路的吸濾器放入裝有準(zhǔn)備好的流動相的儲液瓶中；
4.5.2逆時(shí)針轉(zhuǎn)動A/B泵的排液閥180°，打開排液閥；
4.5.3按A/B泵的[purge]鍵，pump指示燈亮，泵大約以9.9ml/min的流速沖洗，3min（可設(shè)定）后自動停止；
4.5.4將排液閥順時(shí)針旋轉(zhuǎn)到底，關(guān)閉排液閥。
4.5.5如管路中仍有氣泡，則重復(fù)以上操作直至氣泡排盡。
4.5.6如按以上方法不能排盡氣泡，從柱入口處拆下連接管，放入廢液瓶中，設(shè)流速為5ml/min，按[pump]鍵，沖洗3min后再按[pump]鍵停泵，重新接上柱并將流速重設(shè)為規(guī)定值。
4.6平衡系統(tǒng)
4.6.1按《N2000色譜數(shù)據(jù)工作站操作規(guī)程》打開“在線色譜工作站”軟件，輸入實(shí)驗(yàn)信息并設(shè)定各項(xiàng)方法參數(shù)后，按下“數(shù)據(jù)收集”頁的[查看基線]按鈕。
4.6.2等度洗脫方式
4.6.2.1按A泵的[pump]鍵，A、B泵將同時(shí)啟動，pump指示燈亮。用檢驗(yàn)方法規(guī)定的流動相沖洗系統(tǒng)，一般zui少需6倍柱體積的流動相。
4.6.2.2檢查各管路連接處是否漏液，如漏液應(yīng)予以排除。
4.6.2.3觀察泵控制屏幕上的壓力值，壓力波動應(yīng)不超過1MPa。如超過則可初步判斷為柱前管路仍有氣泡，按4.5.6操作。
4.6.2.4觀察基線變化。如果沖洗至基線漂移<0.01mV/min，噪聲為<0.001mV時(shí)，可認(rèn)為系統(tǒng)已達(dá)到平衡狀態(tài)，可以進(jìn)樣。
4.6.3梯度洗脫方式
4.6.3.1以檢驗(yàn)方法規(guī)定的梯度初始條件，按4.6.2項(xiàng)下方法平衡系統(tǒng)。
4.6.3.2在進(jìn)樣前運(yùn)行1~2次空白梯度。方法：按A泵的[run]鍵，prog.run指示燈亮，梯度程序運(yùn)行；程序停止時(shí)，prog.run指示燈滅。
4.7進(jìn)樣
4.7.1進(jìn)樣前按檢測器[zero]鍵調(diào)零，按軟件中[零點(diǎn)校正]按鈕校正基線零點(diǎn)，再按一下[查看基線]按鈕使其彈起。
4.7.2用試樣溶液清洗注射器，并排除氣泡后抽取適量。
造成這種情況的原因一般是色譜柱被污染，或柱頭填料塌陷導(dǎo)致的。
對于第一種情況，先用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長短由樣品污染的情況而定)，再換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳，則考慮第二種情況。
對于第二種情況，擰開柱頭，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分(污染的填料)，裝入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平，滴甲醇，再壓緊反復(fù)幾次，直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈，擦凈柱外壁的填料，擰緊柱頭，用純甲醇沖洗30分鐘以上。
如何排除液相色譜儀氣泡溢出故障？
流動相內(nèi)產(chǎn)生都無法清除不斷產(chǎn)生的氣泡，主要是因?yàn)檫^濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi)，過濾器內(nèi)部由于霉菌的生長繁殖，形成菌團(tuán)，阻塞了過濾器，緩沖液難以流暢地通過過濾器，空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過濾器進(jìn)入流動相。
過濾器浸泡于5%硝酸溶液中，超聲清洗幾分鐘即可；亦可將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小時(shí)，輕輕震蕩幾次，再將過濾器用純水清洗幾次，打開泄壓閥，打開purge鍵清洗脫氣，如仍有氣泡不斷從過濾器冒出，繼續(xù)將過濾器浸泡于5%硝酸溶液中，如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出，說明過濾器內(nèi)部的霉菌菌團(tuán)已被硝酸破壞，流動相可以流暢地通過過濾器。打開泄壓閥，打開泵，流速調(diào)至1.0～3.0ml/min，純水沖洗過濾器1小時(shí)左右。即可將過濾器清洗干凈。關(guān)閉泄壓閥，純甲醇沖洗半小時(shí)即可。
自檢時(shí)有時(shí)會出現(xiàn)“鎢燈能量低”的錯誤？
一般來說，原因是系統(tǒng)中有擋光物，光路偏離，鎢燈電源系統(tǒng)或鎢燈燈泡已壞。這時(shí)首先要檢查光度室是否有擋光物；打開檢測器光源室蓋，檢查氘燈是否點(diǎn)亮；如果氘燈不亮，則關(guān)機(jī)，更換新氘燈，換時(shí)，需注意型號；檢查氘燈保險(xiǎn)絲，看是否松動、氧化、燒斷；如果故障，應(yīng)立即更換；再開機(jī)重新自檢；若仍出現(xiàn)上述故障，則重新安裝軟件后再進(jìn)行自檢。
出現(xiàn)壓力波動大，流量不穩(wěn)定？
造成這種情況的原因是系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物，使得兩者不能密封。處理工作中注意觀察流動相的量，保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底，避免吸入空氣，流動相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥，放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。
液相色譜儀峰面積重復(fù)性不好？
主要原因可能有進(jìn)樣閥漏液、加樣針不到位或液量不足。針對第一種情況，處理時(shí)應(yīng)對更換進(jìn)樣閥墊圈；對于第二種情況保證加樣針插到底，注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJECT狀態(tài)，以保證進(jìn)樣量的準(zhǔn)確。日常工作中，液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要，如要注意不要讓空氣進(jìn)入輸液系統(tǒng)和高壓泵中，儲液器內(nèi)的溶液如長時(shí)間未用應(yīng)清洗儲液器并更換溶液，每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈，防止無機(jī)鹽析出或沉積；樣品的前處理也很重要，任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì)，完全溶解，盡量減少對色譜柱的污染，以延長色譜柱的使用壽命，同時(shí)避免注射過濃的樣品溶液，以免殘留液在進(jìn)樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞；色譜柱作好標(biāo)記，用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。
液相色譜柱壓升高？
造成柱壓升高的原因很多。一般是由于柱床內(nèi)產(chǎn)生了異常的占位性物體，造成流體阻力加大所引起的。例如，緩沖液鹽分如(乙酸銨等)沉積于柱內(nèi)，或樣品污染沉積。針對第一種情況，處理時(shí)應(yīng)先用40～50℃的純水，低速正向沖洗柱子，待柱壓逐漸下降后，相應(yīng)提高流速沖洗，柱壓大幅度下降后，用常溫純水沖洗，之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘；對于第二種情況，由樣品的沉積引起污染的C18柱，和純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇(4+6)沖洗柱子(沖洗時(shí)間的長短由樣品污染的情況而定)，再用換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。
液相色譜使用較多的是紫外檢測器，為了使一些沒有紫外吸收或紫外吸收很弱的化合物能被紫外檢測器檢測，往往通過衍生化反應(yīng)在這些化合物的分子中引入有強(qiáng)紫外吸收的基團(tuán)：2,4-二硝基苯、苯甲基、對硝基苯甲基、3,5-二硝基苯甲基、苯甲酸酯、對甲苯酰、對氯苯甲酸制、對硝基苯甲酸酯、對甲氧基苯甲酸酯、苯甲酰甲基、對溴苯甲酰甲基，這些衍生物可被紫外檢測器檢測。 大多數(shù)紫外衍生反應(yīng)來自經(jīng)典的光度分析和有機(jī)定量分析，新的衍生化反應(yīng)和衍生化試劑是隨液相發(fā)展而發(fā)展的，這些反應(yīng)的原理都來自有機(jī)合成，所以就要求操作者對有機(jī)合成有所了解。但是，由于柱前衍生化是為色譜分析準(zhǔn)備樣品，處理樣品的量小（mg級），所用的小型和微型反應(yīng)器皿又不同于常量的有機(jī)合成，而是類似于近年來發(fā)展的微量有機(jī)合成。紫外衍生化反應(yīng)要選擇反應(yīng)產(chǎn)率高、重復(fù)性好的反應(yīng)。過量試劑和試劑中的雜質(zhì)如果干擾下一步的色譜分離和檢測，則在色譜進(jìn)樣前要進(jìn)行純化分離。還要注意反應(yīng)介質(zhì)對紫外吸收的影響?！ 。?）苯甲?；磻?yīng)：苯甲酰氯及其衍生物--對硝基苯甲酰氯、3,5-二甲基苯甲酰氯和對甲氧基苯甲酰氯都可以同胺、醇和酚類化合物反應(yīng)，生成紫外吸收的苯甲酸酯類衍生物； （2）2,4-二硝基氟代苯（DNFB）的反應(yīng)：DNFB與醇的反應(yīng)產(chǎn)率很低，但可與大多數(shù)伯胺、仲胺和氨基酸反應(yīng)，生成強(qiáng)紫外吸收的苯胺類衍生物； ?。?）苯基異硫氰酸酯（PITC）的反應(yīng)：PITC可與氨基酸反應(yīng)，生成苯基己丙酰硫脲衍生物--PTH氨基酸； ?。?）苯基磺酰氯的反應(yīng)：苯基磺酰氯可與伯胺和仲胺反應(yīng)。 甲苯磺酰氯可與多氨基化合物反應(yīng)，不僅能提高它們的檢測靈敏度，還可改變HPLC的分離度?！ 。?）有機(jī)酸的酯化反應(yīng)：有機(jī)酸很容易與酰溴基反應(yīng)生成酯，常用的酰溴基試劑有苯甲酰溴、甲氧基苯甲酰溴、對溴基苯甲酰溴和對硝基苯甲酰溴等； 酯化反應(yīng)在極性溶劑（如乙腈、丙酮或四氫呋喃）中進(jìn)行，有時(shí)需要加催化劑，如冠醚加鉀離子、二乙胺或N-二異丙基胺等。 ?。?）羰羥基化合物的反應(yīng)：醛類和酮類中的羰基可與2,4-二硝基苯肼（DNPA）反應(yīng)，反應(yīng)在弱酸性條件下進(jìn)行，生成苯腙衍生物?！ ◆驶衔镞€可以與對甲基芐基羥胺（PNBA）在堿催化下反應(yīng)，生成有強(qiáng)紫外吸收的肟。
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