液相色譜儀根據(jù)固定相是液體或是固體，又分為液-液色譜(LLC)及液-固色譜(LSC)。現(xiàn)代液相色譜儀由高壓輸液泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、色譜柱、檢測器、信號記錄系統(tǒng)等部分組成。與經(jīng)典液相柱色譜裝置比較，具有高效、快速、靈敏等特點(diǎn)。對高沸點(diǎn)、難氣化合物的混合物通過色譜柱核淋洗劑并以實(shí)現(xiàn)分離。應(yīng)用于生物化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境化學(xué)、石油化工等部門?！ ∫合嗌V儀3大系統(tǒng) 系統(tǒng)由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相,被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相)內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),在兩相中作相對運(yùn)動(dòng)時(shí),經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出,通過檢測器時(shí),樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來高效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)?！ ?．進(jìn)樣系統(tǒng) 液相色譜儀一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作，進(jìn)樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復(fù)性是有益的?！ ?．輸液系統(tǒng) 該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l．47～4．4X10Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動(dòng)相通過層析柱時(shí)，可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動(dòng)速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存器和梯度儀，可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體)都能獲得有效分離?！ ?、分離系統(tǒng) 該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm(需要兩根連用時(shí)，可在二者之間加一連接管)，內(nèi)徑為2～5mm，由"優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成)．固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達(dá)1000?)和比表面積大的特點(diǎn)，加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣)，或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。因此，這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來。另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小，會(huì)提高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C，通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時(shí)間，就可增加層析柱的效率。
系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。
其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部位。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、與柱或保護(hù)住、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。
下面就介紹下高效液相色譜使用中的幾個(gè)重要環(huán)節(jié)吧。
實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作
1.過濾流動(dòng)相。為了保證流動(dòng)相潔凈，流動(dòng)相使用前都必須微膜過濾。
2.流動(dòng)相脫氣。為了避免流動(dòng)相中氣泡對儀器（氣泡可能會(huì)對儀器及相關(guān)設(shè)備的正常使用及壽命產(chǎn)生一定影響）及分析結(jié)果的影響。
3.運(yùn)行液相泵前盡量先清洗泵柱塞部件。清洗液一般采用10%甲醇溶液，也有采用10%異丙醇溶液
（5%甲醇或異丙醇等有機(jī)相溶液能避免微生物污染，但濃度不能太高，高于20%緩沖液可能會(huì)導(dǎo)致鹽結(jié)晶析出，碰到酸堿類物質(zhì)可能會(huì)有比較強(qiáng)烈的反應(yīng)；另外異丙醇粘度較大，清洗能力較強(qiáng)；也有采用純水清洗的，這樣如果儀器每天使用還行，如果長期不用，為了防止微生物繁殖，純水還得用含有有機(jī)相的清洗液置換出去）
沖洗，這是為了保護(hù)泵柱塞和密封圈等部件在泵運(yùn)行時(shí)不被結(jié)晶鹽等磨損而導(dǎo)致泵頭漏液。
4.每天運(yùn)行儀器前先排氣。一般的液相色譜儀都有排氣功能，沒有的可以不接色譜柱開機(jī)運(yùn)行幾分鐘排氣。
5.泵運(yùn)行時(shí)盡量不采用大流量模式（主要是換流動(dòng)相或排氣泡等，流量盡量設(shè)為3.0ml/min以內(nèi)，這樣更有利于保護(hù)泵柱塞桿和密封圈等部件的壽命）。
6.分析前先對色譜系統(tǒng)（整個(gè)流路）進(jìn)行沖洗及平衡，尤其是色譜柱。先用純甲醇沖洗30分鐘，再換10%甲醇水溶液沖洗30分鐘，最后換含緩沖鹽或酸堿類物質(zhì)的流動(dòng)相平衡30分鐘。色譜柱如果長期沒用，每一步?jīng)_洗、平衡量盡量為色譜柱柱容量20倍以上）。
如果流動(dòng)相中不含緩沖鹽或酸堿類物質(zhì)，純甲醇沖洗完可直接換為流動(dòng)相。使用色譜柱前知道或懷疑色譜柱中殘留有或酸堿鹽類物質(zhì)，在用純甲醇沖洗前增加一步10%甲醇水溶液沖洗。
7.如果色譜柱需要控溫（升溫），要先運(yùn)行泵后再設(shè)柱溫箱溫度。
8.待儀器運(yùn)行穩(wěn)定后（基線基本走平后，這個(gè)是經(jīng)驗(yàn)值），方可進(jìn)樣。
樣品前處理
1.樣品濃度不要太大，雜質(zhì)不要太多，否則色譜柱處理起來壓力很大。
2.進(jìn)樣前樣品一定得先經(jīng)微膜（一般采用0.22um或0.45um微膜）過濾。
實(shí)驗(yàn)過程中注意事項(xiàng)
1.為了避免進(jìn)樣器殘留影響，進(jìn)樣前先對進(jìn)樣器進(jìn)行清洗（這個(gè)不是必須的，但盡量是每進(jìn)一針樣品或標(biāo)準(zhǔn)品前都清洗進(jìn)樣器和進(jìn)樣針，當(dāng)然同一樣品也可以不洗，不同樣品盡量洗），清洗順序?yàn)榧兯⒓状?、流?dòng)相。
2.每進(jìn)一針樣品后要對系統(tǒng)進(jìn)行一次沖洗、平衡后再進(jìn)下一針樣品（等度要求不高，梯度要求相對高，主要是沖洗色譜柱中殘留的強(qiáng)保留物質(zhì)）。
實(shí)驗(yàn)完畢的后續(xù)工作
1.做完樣要先清洗進(jìn)樣器，清洗順序?yàn)榧兯?、甲醇?/p>
2.關(guān)閉柱溫箱溫度設(shè)置。
3.沖洗色譜系統(tǒng)及色譜柱。先用10%甲醇水溶液沖洗30分鐘后換為純甲醇沖洗30分鐘，待基線基本走平停泵。如果流動(dòng)相中不含緩沖鹽或酸堿類物質(zhì)，沖洗時(shí)流動(dòng)相可直接換為純甲醇。色譜柱用完后如果長時(shí)間內(nèi)不會(huì)再用，純甲醇沖洗量要大于色譜柱柱容量20倍以上的，沖洗后卸下，兩端密封保存。
4.待色譜柱溫度降至接近于室溫時(shí)再停泵、關(guān)機(jī)（這一點(diǎn)需特別注意，目的是防止溫度過高損壞色譜柱）。
5.關(guān)機(jī)前用清洗液清洗柱塞桿。
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