色譜是一種分離分析手段,分離是核心,因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對(duì)色譜柱的要求是柱效高、選擇性好,分析速度快等。
一、物理因素:
(1)硅膠純度:硅膠純度和殘留金屬離子濃度,硅膠的雜質(zhì)會(huì)影響化合物的峰形,硅膠表面的金屬含量高會(huì)影響堿性化合物的峰形,易發(fā)生拖尾。
(2)色譜柱尺寸填料床的長(zhǎng)度和內(nèi)徑,增加色譜柱長(zhǎng)度,可以在一定程度上提高柱效,但也會(huì)升高壓力和導(dǎo)致峰展寬;寬柱徑,提高載樣量,但也會(huì)增加橫向擴(kuò)散,同樣會(huì)導(dǎo)致峰展寬。窄柱徑可以節(jié)約溶劑,可減少橫向擴(kuò)散,但壓力較大,對(duì)系統(tǒng)要求較高。
(3)顆粒形狀及粒徑球形顆粒柱效高、重現(xiàn)性好、柱床結(jié)構(gòu)均勻,不規(guī)則形柱床結(jié)構(gòu)不均勻、流動(dòng)相線速度不均勻,容易譜帶展寬;平均顆粒直徑,粒徑越小,柱效越高,柱壓也越高。粒徑分布越廣則柱效越低,壓力越大。
(4)顆粒表面積:顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和,以m2/g表示,相對(duì)而言高表面積對(duì)樣品具有較強(qiáng)的保留能力,更大的柱容量和分離度。而低表面積能更快達(dá)到平衡狀態(tài),更適合梯度洗脫程序。
(5)孔徑:顆粒的孔或腔的平均尺寸,范圍是80~300?,大孔徑的填料顆??梢匝娱L(zhǎng)大分子溶質(zhì)在填料表面的滯留時(shí)間,改善分離,所以大孔徑填料適合分離大分子化合物或者水動(dòng)力體積較大的分子。
二、化學(xué)因素:
(1)鍵合類型及鍵合相:鍵合相分子與基體單點(diǎn)相連為單體鍵合,這種鍵合方式可以提高傳質(zhì)速率,縮短柱平衡時(shí)間;聚合體鍵合為鍵合相分子與基體多點(diǎn)相連,這種鍵合方式可以增加色譜柱穩(wěn)定性,增加載樣量。而鍵合相不同會(huì)直接影響化合物的保留行為。
(2)碳覆蓋率:高碳覆蓋率可以提高分辨率和重現(xiàn)性,但分析時(shí)間長(zhǎng)。
(3)封端:硅膠鍵合相填料中有部分未封端的殘留硅羥基,如圖封端可以減輕待測(cè)組分與硅膠表面殘留的酸性硅羥基反應(yīng),改善保留和峰行,這對(duì)于堿性化合物尤其重要。而不同的封端技術(shù)也會(huì)直接影響色譜柱的效能。
在日常分離分析工作中,色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要,色譜柱使用是否得當(dāng),直接影響色譜柱的壽命,稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過(guò)程中,需要注意下列問題,以維護(hù)色譜柱。
(1)柱子在裝卸、更換時(shí),動(dòng)作要輕,接頭擰緊要適度。必須防止較強(qiáng)的機(jī)械振動(dòng),以免柱床產(chǎn)生空隙。
(2)如果儀器用來(lái)做儀器分析 ,樣品種類有限,但分析次數(shù)多,則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根專用柱,這樣有助于延長(zhǎng)柱子的壽命。
(3)避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料,因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行,在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩。
(4)應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,特別是反相色譜中,不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?,反之亦然?/p>
(5)如使用柱溫控制裝置時(shí),應(yīng)注意在通人流動(dòng)相后才能升溫。
(6)一般說(shuō)來(lái)色譜柱不能反沖,只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí),才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
(7)選擇使用適宜的流動(dòng)相,以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一個(gè)預(yù)柱,分析柱是鍵合硅膠時(shí),預(yù)柱為硅膠,可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”,避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。
(8)避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi),需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一個(gè)保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。
(9)經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱,清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí),對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡,每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右,即常規(guī)分析需要50-75mL。
(10)保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇,柱接頭要擰緊,防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。
(11)色譜柱使用過(guò)程中,如果壓力升高,一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞,這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗;另一種可能是大分子進(jìn)人柱內(nèi),使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形,則可能柱頭出現(xiàn)塌陷,死體積增大。
(12)在完成分離分析工作之后,不應(yīng)立即停機(jī),需及時(shí)對(duì)色譜分析系統(tǒng)進(jìn)行沖洗,一般0.5h以上,以除去色譜柱內(nèi)的雜質(zhì)