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激光掃描共聚焦熒光顯微鏡的成像原理和基本結(jié)構(gòu) 顯微鏡操作規(guī)程

時間:2020-05-16    來源:儀多多儀器網(wǎng)    作者:儀多多商城     
  【儀器網(wǎng) 使用手冊】激光掃描共聚焦熒光顯微鏡是一種利用計算機、激光和圖像處理技術(shù)獲得生物樣品三維數(shù)據(jù)、先進(jìn)的分子細(xì)胞生物學(xué)的分析儀器。主要用于觀察活細(xì)胞結(jié)構(gòu)及特定分子、離子的生物學(xué)變化,定量分析,以及實時定量測定等。
 
  成像原理
 
  采用點光源照射標(biāo)本,在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點,該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集,并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔,分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致,約100-200nm;相對于焦平面上的光點,兩者是共軛的,即光點通過一系列的透鏡,終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣,來自焦平面的光,可以會聚在探測孔范圍之內(nèi),而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品,探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應(yīng)光點的共聚焦圖像,轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計算機,終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。
 
  每一幅焦平面圖像實際上是標(biāo)本的光學(xué)橫切面,這個光學(xué)橫切面總是有一定厚度的,又稱為光學(xué)薄片。由于焦點處的光強遠(yuǎn)大于非焦點處的光強,而且非焦平面光被針孔濾去,因此共聚焦系統(tǒng)的景深近似為零,沿Z軸方向的掃描可以實現(xiàn)光學(xué)斷層掃描,形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學(xué)切片。把X-Y平面(焦平面)掃描與Z軸(光軸)掃描相結(jié)合,通過累加連續(xù)層次的二維圖像,經(jīng)過專門的計算機軟件處理,可以獲得樣品的三維圖像。即檢測針孔和光源針孔始終聚焦于同一點,使聚焦平面以外被激發(fā)的熒光不能進(jìn)入檢測針孔。
 
  激光共聚焦的工作原理簡單表達(dá)就是它采用激光為光源,在傳統(tǒng)熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上,附加了激光掃描裝置和共軛聚焦裝置,通過計算機控制來進(jìn)行數(shù)字化圖像采集和處理的系統(tǒng)。
 
  基本結(jié)構(gòu)
 
  激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)主要包括掃描模塊、激光光源、熒光顯微鏡、數(shù)字信號處理器、計算機以及圖像輸出設(shè)備等。
 
  (1)掃描模塊
 
  掃描模塊主要由針孔光欄(控制光學(xué)切片的厚度)、分光鏡(按波長改變光線傳播方向)、發(fā)射熒光分色器(選擇一定波長范圍的光進(jìn)行檢測)、檢測器(光電倍增管)組成。熒光樣品中的混合熒光進(jìn)入掃描器,經(jīng)過檢測針孔光欄、分光鏡和分色器選擇后,被分成各單色熒光,分別在不同的熒光通道進(jìn)行檢測并形成相應(yīng)的共焦圖象,同時在計算機屏幕上可以顯示幾個并列的單色熒光圖象及其合成圖象。
 
  (2)熒光顯微鏡系統(tǒng)
 
  顯微鏡是LSCM的主要組件,它關(guān)系到系統(tǒng)的成像質(zhì)量。顯微鏡光路以無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)可方便地在其中插入光學(xué)選件而不影響成像質(zhì)量和測量精度。物鏡應(yīng)選取大數(shù)值孔徑平場復(fù)消色差物鏡,有利于熒光的采集和成像的清晰。物鏡組的轉(zhuǎn)換,濾色片組的選取,載物臺的移動調(diào)節(jié),焦平面的記憶鎖定都應(yīng)由計算機自動控制。
 
  激光掃描共聚焦顯微鏡所用的熒光顯微鏡大體與常規(guī)熒光顯微鏡相同,但又有其特點:需與掃描器連接,使激光能進(jìn)入顯微鏡物鏡照射樣品,并使樣品發(fā)射的熒光到達(dá)檢測器;需有光路轉(zhuǎn)換裝置,即汞燈與激光轉(zhuǎn)換,同時汞燈光線強度可調(diào)。
 
 ?。?)常用激光器
 
  激光掃描共聚焦顯微鏡使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng),常用的激光器包括以下三種類型:
 
  半導(dǎo)體激光器:405nm(近紫外譜線)
 
  氬離子激光器:457nm、477nm、488nm、514nm(藍(lán)綠光)
 
  氦氖激光器:543nm(綠光-氦氖綠激光器)633nm (紅光—氦氖紅激光器)
 
  UV激光器(紫外激光器):351 nm、364 nm(紫外光)
 
 ?。?)輔助設(shè)備
 
  風(fēng)冷、水冷冷卻系統(tǒng)及穩(wěn)壓電源。
 
  激光掃描共聚焦顯微鏡的基本工作原理是首先由激光器發(fā)射的一定波長的激發(fā)光,光線經(jīng)放大后通過掃描器內(nèi)的照明針孔光欄形成點光源,由物鏡聚焦于樣品的焦平面上,樣品上相應(yīng)的被照射點受激發(fā)而發(fā)射出的熒光,通過檢測孔光欄后,到達(dá)檢測器,并成像于計算機監(jiān)視屏上。這樣由焦平面上樣品的的每一點的熒光圖像組成了一幅完整的共焦圖像,稱為光切片。
 

倒置熒光顯微鏡的適用

    倒置熒光顯微鏡是指與一般顯微鏡相比,其物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來,由熒光附件與顯微鏡有機結(jié)合構(gòu)成的顯微鏡。

    激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面,被反射到物鏡中并聚集在樣品上,樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進(jìn)入物鏡,經(jīng)雙色束分離器使激發(fā)光和熒光分開而成像。

    物鏡和聚光鏡的工作距離很長,能直接對培養(yǎng)皿中的被檢物體進(jìn)行顯微觀察和研究。

    適用于土壤微生物培養(yǎng)實驗,具有在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行顯微觀察的特點,可以觀察不經(jīng)染色的透明活體。

    特別適用于對活體細(xì)胞和細(xì)胞離體培養(yǎng)等顯微觀察。

    高信噪比(S/N),能夠捕獲極弱熒光

    光學(xué)品質(zhì)--對現(xiàn)代生命科學(xué)研究至關(guān)重要

    熒光觀察的理想情況是采用最低量的激發(fā)光照射捕獲高對比度的圖像,由此將細(xì)胞受損及熒光衰減的機會降至最小。

    對UIS2系統(tǒng)的物鏡進(jìn)行精密的設(shè)計,使用微弱的激發(fā)光即可捕獲明亮的熒光圖像。光透過率進(jìn)步的同時也提高了UIS2光學(xué)系統(tǒng)的信噪比。

    干涉鍍膜熒光激發(fā)塊的性能改進(jìn)熒光激發(fā)塊的干涉膜采用了新型鍍膜技術(shù),激發(fā)帶寬(BP)以及熒光帶寬(BA)比傳統(tǒng)譜線縮短了6nm,使信噪比更進(jìn)一步得到提高。

    熒光激發(fā)塊采用硬鍍膜技術(shù),大大延長了激發(fā)塊的使用壽命,提高了在潮濕環(huán)境中的使用性能。

    熒光蛋白專用高質(zhì)量熒光激發(fā)塊

    BX2系列HQ型熒光激發(fā)塊較為適宜的波長是ECFP/EFP/EYFP/DsRed。高銳化鍍膜以及高透過率(90%-95%)可有效地透過熒光蛋白所發(fā)射的熒光。

    這樣,即使采用微弱的激發(fā)光仍可觀察到明亮的圖像,同時,防止熒光衰減,并將細(xì)胞受損的可能減至最小。

    減少雜散光的功能

    當(dāng)在分光鏡對激發(fā)光進(jìn)行反射時,雜散光的微量透射就可造成噪聲上升。

    熒光激發(fā)塊經(jīng)由其獨特的光吸收涂層可吸收99%以上的雜散光,減少信號干擾,獲得高質(zhì)量圖像。

    熒光成像用高數(shù)值孔徑物鏡

    BX2系列具有新研制的PLAPON60XO物鏡的特點,提供了當(dāng)今普通觀察方法用物鏡最高的數(shù)值孔徑(N.A.:1.42),用于熒光成像,同時具有先進(jìn)的通用特性。

    除了其突出的熒光信噪比之外,也可進(jìn)行紫外激發(fā),這在以前的普通顯微鏡是不能做到的。

    UPLSAPO100×O物鏡在340nm處(紫外)仍然維持著高透過率。

標(biāo)簽: 倒置熒光顯微鏡
倒置熒光顯微鏡標(biāo)簽: 倒置熒光顯微鏡的適用_倒置熒光顯微鏡組合標(biāo)題:

顯微鏡的目鏡和物鏡介紹

    目鏡(eyepiece)的功能只在于放大由物鏡所完成的物像。最普通的目鏡就是惠更斯目鏡。為了彌補物鏡在成像過程中所造成的像差,可以使用補償目鏡。補償目鏡的鏡筒上刻有英文“C",俄文“K”字母。這是補償一詞compensation或KoMneHCaQM,的字頭。    為了觀察者的視覺愉快使視野廣闊,各大廠家出售著廣視野高接點目鏡。這種目鏡的視場數(shù)值已達(dá)25mm,并且?guī)а坨R者不必摘眼鏡就可以觀察.這種目鏡的外殼上刻有眼鏡框像。用于顯微照像的專用長焦距目鏡上刻有英文photoeyepiece或俄文q0TO字樣.使相差顯微鏡的位相板和環(huán)狀光欄的調(diào)焦中可用調(diào)焦望遠(yuǎn)目鏡.這種目鏡是兩層鏡筒相套,可伸可縮的目鏡。    偏振光顯微鏡上可以選配測角目鏡。測角目鏡的里面裝有十字劃線,鏡簡外側(cè)刻有360??潭鹊霓D(zhuǎn)盤與載物臺的360°刻度相配用。組織學(xué)教學(xué)工作上使用示教目鏡很方便.這是一個鏡簡上方用棱鏡分光而由兩個或更多數(shù)目的接目透鏡兩人或多人同時觀察一個目標(biāo)的目鏡。在目鏡內(nèi)部還裝有指示針。所謂的測微目鏡實際上在任一種類的目鏡中安裝目鏡測微尺的鏡。    物鏡(objective)對于麥克奧迪顯微鏡來說應(yīng)算比較貴重的部件。一只高性能物鏡的價格占這類顯微鏡本身的1/3-1/2。因為顯微鏡的基礎(chǔ)性能—成像和分辨本領(lǐng)決定于物鏡。為了消除成像過程中的球面差和色差、物鏡的透鏡組由單透鏡發(fā)展為許多層次的復(fù)合透鏡組。由3-4透鏡已增加到7-9片透鏡或透鏡復(fù)合體。物鏡的鏡體上都刻有物鏡的性能,物鏡的鏡口率、放大倍數(shù)以及特殊物鏡的標(biāo)記字樣.消色差物鏡的外殼上刻有英,德,法Achromat字樣或俄文AXP字樣.這種物鏡能夠消除光譜中的紅光和青光所造成的色差而不能消除其他色光形成的色差。    復(fù)消色差物鏡是性能可以,價格比較貴的物鏡.其外殼上刻有英、德、Apochromat(簡字Apo)字樣或俄文Ail。字樣。其透鏡質(zhì)料好,透鏡組層次較多,組合得精確能夠消除紅光、黃光、藍(lán)光造成的色差。這種物鏡配用補償目鏡時能夠發(fā)揮光學(xué)顯微鏡的最高性能。    熒石物鏡外殼刻有英、德、法文Fluormat(或Flur)字樣.這是能透過紫外光的專用于熒光顯微鏡的物鏡。如果當(dāng)普通物鏡使用,則分辨率太低.    平像場系列物鏡刻有Planochromat字樣。Opton公司出售的有平像場熒石消色差物鏡(Plan-Neofluor),平像場復(fù)消色差物鏡(Plan-Achromat),平像場熒石消色差偏光物鏡(Plan-Neofluorpol)等。    相差顯微鏡必須配備相差物鏡.這種物鏡刻有英、德、法文Pha或俄文)字樣。    單色物鏡(monochromat)是全部透鏡用融熔水晶制成的貴重物鏡。這種物鏡是透過紫外線的專用于紫外光干涉顯微鏡或用于紫外光顯微分光光度計上。如果這種物鏡不能到手時,可用復(fù)消色差物鏡代替。

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