液相色譜法是一種以液體為流動(dòng)相的色譜法，液相色譜法是現(xiàn)在應(yīng)用十分廣泛的一種液相色譜法，這種方法是20世紀(jì)60年代興起的，經(jīng)過(guò)不斷的完善和發(fā)展，現(xiàn)已被應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。在醫(yī)藥分析領(lǐng)域，液相檢驗(yàn)的應(yīng)用已經(jīng)普及，而液相色譜法作為液相檢驗(yàn)中的一種重要手段，也得到了大力的推廣與應(yīng)用，目前實(shí)驗(yàn)室常用的P230液相色譜儀。
液相色譜法及其系統(tǒng)構(gòu)造
液相色譜法是以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，通過(guò)引入氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。區(qū)別于經(jīng)典液相色譜法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，液相色譜法采用了高壓泵、固定相和高靈敏度檢測(cè)器等技術(shù)，因此其檢測(cè)有高壓、高速、、高靈敏度、檢驗(yàn)速度快、分辨率高等特點(diǎn)，更適宜于分離、分析熱穩(wěn)定性差、高沸點(diǎn)、有生理活性及相對(duì)分子量比較大的物質(zhì)。
HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、溶劑貯存器、檢測(cè)器、檢測(cè)數(shù)據(jù)記錄器等組成。其中輸液泵、色譜柱和檢測(cè)器關(guān)鍵。制備型HPLC儀有餾分收集裝置。新型HPLC儀增加了微機(jī)控制，可進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。
輸液泵性能的好壞直接影響分析結(jié)果的可靠性，好的輸液泵應(yīng)具備輸出壓力高，流量穩(wěn)定、耐腐蝕，密封性能好，液缸容積小等特點(diǎn)；HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣裝置需要：密封性能好，重復(fù)性好，死體積小，對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響??；色譜柱擔(dān)負(fù)分離作用，是色譜系統(tǒng)的心臟，在選擇色譜柱時(shí)要注意選擇柱效高、選擇性好，分析速度快的色譜柱；檢測(cè)器是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，其要求線性范圍寬、靈敏度高、重復(fù)性好、噪音低和適用范圍廣。
液相色譜的原理及分類
液相色譜的原理主要依靠分離機(jī)制，其分離方法有多種，相應(yīng)的分離機(jī)制也不同。根據(jù)分離機(jī)制的不同主要有四種基本類型色譜法：吸附色譜、分配色譜、分子排阻色譜及離子交換色譜法，其他還有膠束色譜法、化學(xué)鍵合色譜法及親和色譜法等類別。在液相檢驗(yàn)中，分離是核心，而色譜是一種分離分析手段。無(wú)論是那種分離方法，其分離原理都是一個(gè)物理過(guò)程，與液相層析的原理相似：將要檢測(cè)分析的化合物通過(guò)進(jìn)樣器放入液相色譜儀，流動(dòng)相攜帶著其流過(guò)色譜柱，由于不同物質(zhì)在固定相上的保留時(shí)間不同出現(xiàn)的峰高或者峰面積定量以及出峰時(shí)間的不同而達(dá)到分離，從而或檢測(cè)藥物中不同成分的含量、或分析藥效，或測(cè)定藥物殘留物雜質(zhì)成分的濃度。
藥物含量檢驗(yàn)中液相色譜的應(yīng)用
藥物含量檢驗(yàn)中定量分析的準(zhǔn)確與否，關(guān)鍵在于檢測(cè)器所產(chǎn)生的信號(hào)是否與被測(cè)樣品的量始終呈一定的函數(shù)關(guān)系。液相色譜儀可使輸出信號(hào)與樣品量好呈線性關(guān)系，這樣進(jìn)行定藥物含量測(cè)定時(shí)既準(zhǔn)確又方便。
例如，示差檢測(cè)法就是用液相色譜測(cè)定多糖類藥物，用電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)的陰離子交換柱分離出多糖類藥物，這種方法優(yōu)于傳統(tǒng)檢驗(yàn)法，可直接對(duì)低濃度糖作定量分析，不需衍生和樣品處理，在節(jié)約時(shí)間和資金的同時(shí)避免了有毒衍生試劑的使用。在檢驗(yàn)中不同類型的糖(如單糖、糖胺聚糖、半乳糖、果糖等)適用于不同的離子交換柱。
藥效檢驗(yàn)中液相色譜的應(yīng)用
藥物的治療效果取決于人體對(duì)藥物的吸收，與藥物成分及其代謝物在血液中的濃度有關(guān)。隨著現(xiàn)代藥物的選擇性越來(lái)越高，所服用的劑量越來(lái)越低，這就需要提高藥效?，F(xiàn)階段藥效臨床試驗(yàn)中采用人肝組織，選擇液相色譜法檢測(cè)藥性藥效，對(duì)混合物中微量組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，可搭配固定相和流動(dòng)相以達(dá)到好的分離效果。
例如，用內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)血液中藥物濃度的總量限度。內(nèi)標(biāo)法是液相色譜的一種常用測(cè)定方法。首先提取血液，然后根據(jù)規(guī)定的方法配制不含藥物的溶液，注入到液相色譜儀中，記錄為色譜圖I，然后再配制含有藥物的溶液，以相同的條件注樣，記錄為色譜圖II。然后將圖I與圖II進(jìn)行比較，則可以通過(guò)雜質(zhì)峰確認(rèn)雜質(zhì)峰的面積，從而達(dá)到檢驗(yàn)的效果。
藥物殘留中液相色譜的應(yīng)用
通常藥物在使用一段時(shí)間后在體內(nèi)產(chǎn)生殘留物會(huì)影響認(rèn)得某些生理功能，也就是人們所說(shuō)的食藥三分毒，如何分析藥物殘留物成分，減少其引起的不必要危害，液相色譜法起到了重要的作用。質(zhì)譜儀是完成藥物代謝物毒性鑒定的主要工具，是制藥工業(yè)中毒理學(xué)試驗(yàn)的基礎(chǔ)。
今后的醫(yī)藥分析檢驗(yàn)研究中，可以應(yīng)用液相色譜法不受試樣揮發(fā)性限制等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合其它的先進(jìn)技術(shù)，如色譜——光譜聯(lián)用、柱切換技術(shù)、傅立葉變換紅外線吸收光譜聯(lián)用等，不斷提高液相色譜在液相檢驗(yàn)中的應(yīng)用。
液相色譜儀分離的目的必須十分明確，下面的問(wèn)題在建立方法之初就應(yīng)確定： ?。?）主要目的是什么？定量或定性，還是定性、定量同時(shí)做？； （2）是否有必要解析出樣品的所有成分？譬如可能有必要分離出產(chǎn)品中的所有降解物或雜質(zhì)，以使含量測(cè)定結(jié)果更加可靠，但卻沒(méi)必要將它們彼此完全分開(kāi)?！ 。?）如要求定量分析，準(zhǔn)確度與精密度需多大？樣品主要成分的精密度通常能達(dá)到±1—2%，特別是不需樣品預(yù)處理的情況。 ?。?）特殊化合物可能會(huì)以不同的樣品形式出現(xiàn)（如：原料藥，一種或多種形態(tài)，環(huán)保樣品等）。是否需要一種以上的HPLC方法？單一方法分離不同形態(tài)樣品是否理想？ ?。?）一次將分析多少樣品？當(dāng)必須同時(shí)處理大量樣品時(shí)，運(yùn)行時(shí)間將變得非常重要?！ ∮袝r(shí)甚至為了縮短運(yùn)行時(shí)間而以犧牲樣品分離度作代價(jià)，如縮短柱長(zhǎng)或加快流速。當(dāng)一次分析的樣品數(shù)目超過(guò)10個(gè)，運(yùn)行時(shí)間一般應(yīng)控制在20min以內(nèi)?！ 。?）將要使用該方法的實(shí)驗(yàn)室中，有哪些HPLC設(shè)備？色譜柱能否恒溫系統(tǒng)能否做梯度洗脫？該方法是否可在不同設(shè)計(jì)與生產(chǎn)的設(shè)備上運(yùn)行？ 方法建立實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，應(yīng)明確對(duì)方法的這些要求。
高效液相色譜在使用過(guò)程中常會(huì)出現(xiàn)一些影響分析結(jié)果的問(wèn)題，如果使用人員了解常見(jiàn)問(wèn)題及其成因和相關(guān)解決方法，就能做到早預(yù)防勤維護(hù)，使分析結(jié)果保持較好的穩(wěn)定性與較高的精確性。
1.氣泡溢出
流動(dòng)相內(nèi)有氣泡，關(guān)閉泵，打開(kāi)泄壓閥，打開(kāi)purg鍵，清洗脫氣，氣泡不斷從過(guò)濾器冒出，進(jìn)入流動(dòng)相，無(wú)論打開(kāi)purge鍵幾次，都無(wú)法清除不斷產(chǎn)生的氣泡。原因過(guò)濾器長(zhǎng)期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi)，過(guò)濾器內(nèi)部由于霉菌的生長(zhǎng)繁殖，形成菌團(tuán)，阻塞了過(guò)濾器，緩沖液難以流暢地通過(guò)過(guò)濾器，空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過(guò)濾器進(jìn)入流動(dòng)相。處理過(guò)濾器浸泡于5%硝酸溶液中，超聲清洗幾分鐘即可；亦可將過(guò)濾器浸泡于5%硝酸溶液中12~36小時(shí)，輕輕震蕩幾次，再將過(guò)濾器用純水清洗幾次，打開(kāi)泄壓閥，打開(kāi)purge鍵清洗脫氣，如仍有氣泡不斷從過(guò)濾器冒出，繼續(xù)將過(guò)濾器浸泡于5%硝酸溶液中，如沒(méi)有氣泡不斷從過(guò)濾器中冒出，說(shuō)明過(guò)濾器內(nèi)部的霉菌菌團(tuán)已被硝酸破壞，流動(dòng)相可以流暢地通過(guò)過(guò)濾器。打開(kāi)泄壓閥，打開(kāi)泵，流速調(diào)至1.0~3.0ml/min,純水沖洗過(guò)濾器1小時(shí)左右。即可將過(guò)濾器清洗干凈。關(guān)閉泄壓閥，純甲醇沖洗半小時(shí)即可。
2.色譜柱平衡
如果我們觀察到保留時(shí)間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動(dòng)相完全平衡。通常平衡需要10~20個(gè)柱體積的流動(dòng)相。但如果在流動(dòng)相中加入少量添加劑則需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)平衡色譜柱。需要柱子的充分平衡，然后才能對(duì)HPLC進(jìn)行檢定。
3.柱壓高
⑴緩沖液鹽分如（乙酸銨等）沉積于柱內(nèi)；⑵樣品污染沉積。
處理對(duì)于第一種情況先用40~50℃的純水，低速正向沖洗柱子，待柱壓逐漸下降后，相應(yīng)提高流速?zèng)_洗，柱壓大幅度下降后，用常溫純水沖洗，之后用純甲醇沖洗柱子30分鐘；對(duì)于第二種情況，由樣品的沉積引起污染的C18柱，和純水反向沖洗柱子，換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇（4+6）沖洗柱子，再用換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。
4.無(wú)指示
⑴泵密封墊圈磨損；⑵大量氣泡進(jìn)入泵體。
處理對(duì)于第一種情況，更換密封墊圈；對(duì)于第二種情況，在泵作用的同時(shí)，用一個(gè)50ml的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。
5.不穩(wěn)定
原因系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物，使得兩者不能密封。處理工作中注意觀察流動(dòng)相的量，保證不銹鋼濾器沉入儲(chǔ)液器瓶底，避免吸入空氣，流動(dòng)相要充分脫氣。如為單向閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥，放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。
6.峰分叉
⑴色譜柱被污染；⑵柱頭填料塌陷。
處理對(duì)于第一種情況，先用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇+異丙醇（4+6）沖洗柱子（沖洗時(shí)間的長(zhǎng)短由樣品污染的情況而定），再換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳，則考慮第二種情況。對(duì)于第二種情況，擰開(kāi)柱頭，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分（污染的填料），裝入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平，滴甲醇，再壓緊反復(fù)幾次，直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈，擦凈柱外壁的填料，擰緊柱頭，用純甲醇沖洗30分鐘以上。
7.重復(fù)性差
⑴進(jìn)樣閥漏液；⑵加樣針不到位；⑶液量不足。
處理對(duì)于第一種情況更換進(jìn)樣閥墊圈；對(duì)于第二種情況保證加樣針插到底，注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從LOAD狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJECT狀態(tài)，以保證進(jìn)樣量的準(zhǔn)確。日常工作中，液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要，注意不要讓空氣進(jìn)入輸液系統(tǒng)和高壓泵中，儲(chǔ)液器內(nèi)的溶液如長(zhǎng)時(shí)間未用應(yīng)清洗儲(chǔ)液器并更換溶液，每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈，防止無(wú)機(jī)鹽析出或沉積；樣品的前處理也很重要，任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì)，完全溶解，盡量減少對(duì)色譜柱的污染，以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，同時(shí)避免注射過(guò)濃的樣品溶液，以免殘留液在進(jìn)樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞；色譜柱作好標(biāo)記，用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。
8.基線漂移
一般說(shuō)來(lái)，機(jī)器剛起動(dòng)時(shí)，基線容易漂移，大概要半個(gè)小時(shí)的平衡時(shí)間，如果你用了緩沖溶液或緩沖鹽，還有就是在低波長(zhǎng)下（220 nm）平衡時(shí)間相對(duì)會(huì)比較長(zhǎng)，但如果你在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)基線漂移，則你要考慮下面的原因：
1）柱溫波動(dòng)。解決方法：控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，檢查是否有打開(kāi)的窗戶或空調(diào)對(duì)著柱溫箱；
2）流通池被污染或有氣體。 解決方法：用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池（可以斷開(kāi)柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用鹽酸）；
3）紫外燈能量不足。解決方法：更換新的紫外燈；
4）流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。
解決方法：檢查流動(dòng)相的組成，使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級(jí)的溶劑；
5）樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)（高K’值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線。
解決方法：使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間。在分析過(guò)程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子；
6）檢測(cè)器沒(méi)有設(shè)定在最大吸收波長(zhǎng)處。解決方法：將波長(zhǎng)調(diào)整至最大吸收波長(zhǎng)處；
7）流動(dòng)相的PH值沒(méi)有調(diào)節(jié)好。解決方法：加適量的酸或堿調(diào)至較佳PH值。
高效液相色譜儀系統(tǒng)組成：液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進(jìn)樣器、柱子、柱溫箱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。對(duì)于整個(gè)系統(tǒng)而言，柱子、泵和檢測(cè)器是核心部件同時(shí)也是易出問(wèn)題的主要部位。
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