PCR的工作機制

    PCR由一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，包含前、中、后三個階段。重要的化學(xué)變化是熱循環(huán)期間的產(chǎn)物合成。每次循環(huán)后產(chǎn)物、模板、聚合酶、引物和脫氧核苷酸的余量都會改變，處于連續(xù)的不穩(wěn)定狀態(tài)。所有的循環(huán)都是從模板和先前產(chǎn)物的變性開始。當溫度較低時，引物退火到模板上。

    早先若干循環(huán)的退火步驟要求引物尋找正確的染色體模板作為它們的目標。在中期的循環(huán)中，先前合成的產(chǎn)物優(yōu)先成為模板。最后幾個循環(huán)中，增擴后的高濃度產(chǎn)物互相雜交，由此阻止與引物的雜交。

    引物退火后，Taq DNA聚合酶把自己定位到引物和模板綜合體上，提取介質(zhì)中的自由dNTPs然后沿著模板延伸。從本質(zhì)上講，引物和模板的任何反應(yīng)都會造成產(chǎn)物擴展，它們的特異性在最初的幾個循環(huán)中可能很難控制，得到非特異性產(chǎn)物的摩爾量超過在模板上正確退火位置的量。PCR反應(yīng)特異性的可靠度依賴于2個引物必須定位到互補的DNA鏈上。進一步講，退火溫度和Mg2+離子的濃度影響引物穩(wěn)定的雜交到模板上，雜交位置間距應(yīng)小于10kb。

    相比之下，增擴階段的大部分循環(huán)里，模板被很好的與先前增擴的片段區(qū)分開。這些片段的數(shù)量取決于早先若干個循環(huán)的嚴密性。甄選同源性引物的退火位置是較簡單的，增擴期間由染色體DNA貢獻的有效的模板數(shù)量只是可以忽略一小部分。甄選的復(fù)雜性被超量由引物從互補位點新增擴的片段所降低。

    PCR的化學(xué)計量

    熱力學(xué)方面的影響對PCR來講是試劑濃度和模板間的對應(yīng)關(guān)系。在起先的循環(huán)中PCR試劑的摩爾比率是最高的，隨著PCR產(chǎn)物的增加而降低。令人驚訝的是這種減低是由增擴的目標分子的增加引起的而不是由于試劑的消耗。最初剩余的引物和脫氧核苷酸與模板的比率是固定的，反應(yīng)結(jié)束后，dNTP的濃度下降超過1倍，引物任然剩余95%，Taq DNA聚合酶沒有變化。增擴千萬倍目標分子后，模板分子遠多于酶分子。當產(chǎn)物增加后，酶全部被占用了，引物和模板的比率減低，推動自身退火。當自身退火的數(shù)量增加或酶的總量有限時，反應(yīng)處于飽狀態(tài)并停止指數(shù)級的增長。增擴階段是自我受限的。這個階段之后，熱循環(huán)轉(zhuǎn)向未在最初幾個循環(huán)中被選擇的欺騙性的目標增擴，盡管能夠通過提高開始時Taq DNA聚合酶和引物的含量來維持高試劑比率，但這種修改很可能引起丟失特異性因為引物會胡亂雜交，出現(xiàn)額外的條帶和斑點。

    熱啟動（hot start）PCR

    用于引物設(shè)計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR對提高PCR特異性尤為有效。 盡管Taq DNA聚合酶的較佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在PCR配制過程中，熱循環(huán)剛開始，以及保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。

    限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，無法完全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。熱啟動通過抑制DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。方法包括延緩加入Taq DNA聚合酶，在反應(yīng)體系達到90度時，暫停并保持溫度在70度以上。手工加入聚合酶，這個方法過于煩瑣， 尤其是對高通量應(yīng)用容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分如鎂離子、酶、模板、緩沖液包裹起來，物理地分隔開。熱循環(huán)開始后，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。蠟防護層法與手動熱啟動法一樣比較煩瑣，易受污染，不適用于高通量應(yīng)用。

    還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗體抑制失活，當變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。

    Booster PCR

    整個PCR反應(yīng)過程中引物前后擔任2種功能，篩選探針和增擴引導(dǎo)。在最初的幾個熱循環(huán)期間，每個引物作為探針獨立地活動，篩選所有目標。如果一對引物與目標雜交，方向和位置都正確，就意味著目標選擇的工作完成了。接下來在以后的循環(huán)中這對引物引導(dǎo)增擴反應(yīng)。

    增擴低濃度的模板（等于或小于100個模板）比如單個細胞，石蠟化的組織有不同的特點。篩選階段相對于模板而言要有更多剩余的試劑。稀釋的模板造成難以篩選，因為引物和模板相遇和頻率被大大的降低了。這種情況更有可能引起引物之間形成二聚體。Booster PCR是解決這個問題的方法。在此步驟中，第一個循環(huán)階段使用稀釋后的引物和模板取得固定的引物/模板比例，大約在107:1。以確保開始擴增時的準確性，在增擴階段提高引物的濃度到正常水品。

    嵌套的引物

    如果增擴出的DNA序列嵌套存在于引物退火位置之間，從大范圍看增擴出的目標是同源的。引物雜交的嚴密性在最初若干個循環(huán)里是寬松的，允許較高的錯配偏差。這個效果能通過低于計算得到引物退火溫度來達到。第二步選擇明確的產(chǎn)物，嚴謹?shù)剡x擇一條已知染色體片段用來增擴。簡單點說就是設(shè)計兩對引物, 一對是長的，另一對短的是包含在長引物內(nèi)的，用長引物擴增的產(chǎn)物作為第二次擴增的模板，這樣可以增加產(chǎn)物的量而且可以減少非特異性帶和錯配的情況.

    假陰性

    PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。

    模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

    酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因為酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時PCR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加溴化乙錠。

    引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物使用過程中應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

    假陽性

    引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。

    靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或濺出離心管外。②除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及進樣槍頭均應(yīng)一次性使用。③必要時，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

    出現(xiàn)非特異性擴增帶

    PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次，是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶的量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：①必要時，重新設(shè)計引物。②減低酶的量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸，也叫兩步法)。

    出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

    PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶的量過大或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：①減少酶的量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃 度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)