早期使用隔膜和停流進樣器，裝在色譜柱進口處?，F(xiàn)在大都使用六通進樣閥或自動進樣器。
進樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進樣方式可分為：隔膜進樣、停流進樣、閥進樣、自動進樣。
1.隔膜進樣。
用微量注射器將樣品注進專門設(shè)計的與色譜柱相連的進樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎即是零，可以獲得較佳的柱效，且價格便宜，操縱方便。但不能在高壓下使用(如10MPa以上);此外隔膜輕易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進樣重復(fù)性只能達到1~2%;加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。
2.停流進樣。
可避免在高壓下進樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往會出現(xiàn)“鬼峰”;另一缺點是保存時間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。
3.閥進樣。
一般HPLC分析常用六通進樣閥(以美國Rheodyne公司的7725和7725i型常見)，其關(guān)鍵部件由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進樣(約下降5~10%左右)，但耐高壓(35~40MPa)，進樣量正確，重復(fù)性好(0.5%)，操縱方便。
4.自動進樣。
用于大量樣品的常規(guī)分析。
一、樣品預(yù)處理的重要性：
1、樣品預(yù)處理所用時間遠大于色譜分離時間。
2、消耗大量的溶劑和其它化學(xué)品，占分析消耗總成本最大。
3、樣品預(yù)處理是實驗的重復(fù)性和準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié)，是影響實驗結(jié)果好壞的重要因素。
二、樣品預(yù)處理的目的：
1、除去微粒，減少干擾雜質(zhì)。
2、濃縮微量組分。
3、提高檢測的選擇性和靈敏度。
4、改善分離效果。
5、有利于色譜柱和儀器的保護。
6、使樣品形式和所用溶劑符合HPLC的要求。
三、樣品預(yù)處理達到的要求：
1、樣品全部轉(zhuǎn)化為低濃度溶液。
2、樣品溶液洗脫強度低于流動相，與流動相相溶。
四、樣品預(yù)處理的原則：
1、在樣品預(yù)處理過程中，盡可能防止和避免與待測組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
2、在樣品預(yù)處理過程中，如果與待測組分進行化學(xué)反應(yīng)，那么這一反應(yīng)必須是已知的，而且可以定量的完成。
3、在樣品預(yù)處理過程中，要防止和避免待待測組分被玷污，盡可能減少無關(guān)化合物引入制備過程。
4、樣品的處理過程應(yīng)盡可能簡單易行，所采用的樣品處理裝置尺寸應(yīng)與樣品處理量相適應(yīng)。
5、采樣之后應(yīng)盡可能快的進行樣品的分析測定，或使用合適的方法消除可能的變化和干擾。
五、樣品預(yù)處理方法：
1、過濾、離心：
常用的濾膜材質(zhì)有纖維素、聚四氟乙烯和聚酰胺。其中聚酰胺應(yīng)用廣泛。
2、加速溶劑萃?。?/p>
加速溶劑萃取是在提高溫度（50～200℃）和壓力（10.3～20.6MPa）下，用溶劑萃取固體或半固體樣品。
3、超臨界流體萃?。?/p>
超臨界流體萃取是利用超臨界流體對物質(zhì)的特殊溶解性能原理而建立的萃取方法。
4、固相萃?。?/p>
固相萃取是通過采用選擇性吸附和選擇性洗脫對樣品進行富集、分離和凈化，可以將其近似地看作一種簡單的液固色譜過程。
5、固相微萃取：
固相微萃取是基于涂敷在纖維上的高分子涂層或吸附劑和樣品之間的吸附－解吸平衡原理，集采樣、萃取、濃縮和進樣于一體的無溶劑的樣品微萃取方法。
有直接固相微萃取、頂空固相微萃取、膜固相微萃取和毛細(xì)管固相微萃取等。
6、液相微萃取：
液相微萃取是基于樣品和微升級甚至納升級有機溶劑之間的分配平衡原理，集采樣、萃取和濃縮于一體的環(huán)境友好的樣品微萃取方法。
有直接液相微萃取、中空纖維液相微萃取和頂空液相微萃取等。
7、衍生化：
有紫外衍生化、熒光衍生化和電化學(xué)衍生化等。
1、高效液相色譜儀的基本工作原理
高效液相色譜儀如圖1所示，是由溶液貯器、高壓泵、進樣系統(tǒng)、色譜分離柱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)幾部分組成。
高壓泵從溶液貯器中抽走流動相，流經(jīng)整個儀器系統(tǒng)，形成密閉的液體流路。樣品通過進樣系統(tǒng)注入色譜分離柱，在柱內(nèi)進行分離。柱流出液進入檢測器，使已被分離的組分逐一被檢測器收集，并將響應(yīng)值轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柡蠼?jīng)放大被數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜峰，通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對記錄的峰值進行存儲和計算[1]。
液相色譜儀是依靠色譜柱進行分離的。研究證明：物質(zhì)的色譜過程是指物質(zhì)分子在相對運動的兩相(液相和固相)中分配“平衡”的過程。液相色譜是以具有吸附性質(zhì)的硅膠顆粒為固定相，各種洗脫液為流動相。當(dāng)液體樣品在載體流動相的推動下，在液-固兩相間作相對運動時，由于各組分在兩相中的分配系數(shù)(K)不同，則使各自的移動速度不同，即產(chǎn)生差速遷移。各組分在兩相間經(jīng)過多次分配，從而達到使混合物分離的目的。
2、輸液泵的常見故障及對策：
輸液泵/高壓泵是保證HPLC系統(tǒng)流路暢通、流量精確和壓力穩(wěn)定的重要儀器部件，目前多用往復(fù)式恒流柱塞泵，主要由柱塞桿、密封墊圈和兩個單向閥組成，用馬達帶動凸輪驅(qū)動柱塞桿作吸液和排液的往復(fù)運動。常分為單柱塞泵、并聯(lián)柱塞泵、串聯(lián)柱塞泵和柱塞隔膜泵等類型。流動相混合方式分為低壓混合和高壓混合。常見泵的故障主要有以下幾種，并提供解決的辦法。
2.1單向閥故障 由于球與閥座密封不嚴(yán)，液體倒流，造成壓力不穩(wěn)，甚至球與閥座粘在一起阻死。密封不嚴(yán)主要是污染或氣泡引起，球與閥座粘連也是由于污染和磨損造成。
為避免單向閥中的寶石球和閥座被污染，流動相應(yīng)使用HPLC級的溶劑，并且配好的流動相一定要用0.45u濾膜過濾和脫氣。如果泵被微粒污染，可分別用水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷依次沖洗。沖洗時應(yīng)打開泄液閥，最后再用所用的溶液沖洗整個系統(tǒng)。
氣泡進入閥中會緊貼在閥體的一側(cè)，使寶石球難返回到閥座，引起倒流，泵的壓力和流速會明顯改變。此時，應(yīng)立即打開泄液閥，大流量(2ml/min)沖洗泵，直至排除液為直線型。因為甲醇可潤濕泵內(nèi)壁，擠出氣泡，故也可使用脫過氣的甲醇沖洗泵。長期不用的泵或新裝的泵頭應(yīng)該用甲醇趕氣泡。泵進氣泡也可在泵頭上排氣泡，即用扳手固定住進氣泡的泵頭，擰開輸出管道的壓帽，手動泵送液，可見到氣泡從孔中擠壓出來，直至無氣泡排出將壓帽擰緊。
采取上述辦法仍不能使壓力穩(wěn)定，應(yīng)考慮是否密封墊壞了？或單向閥磨損、球不光滑等，需更換部件。
2.2泵墊圈故障泵墊圈常見的故障是滲漏和墊圈受損污染系統(tǒng)。液相色譜系統(tǒng)一般情況下不要使用強酸強堿溶液，因為這會損壞密封墊和柱塞桿。密封墊圈與運動著的柱塞桿緊密接觸，可使柱塞在泵頭自由運動而流動相不漏出來，它是液相色譜系統(tǒng)中最易磨損的部件。有條件的實驗室可三個月更換一次墊圈，防止泵系統(tǒng)污染。如果用緩沖鹽作流動相則更會加速墊圈的磨損，應(yīng)及時沖洗。當(dāng)墊圈損壞時，表現(xiàn)為：泵壓力不穩(wěn)、泵頭漏液。一旦出現(xiàn)這個現(xiàn)象，應(yīng)盡快更換新墊圈。
為避免上述故障的發(fā)生，我們在分析工作中應(yīng)注意以下幾點：
?、?使用超純水(18MΩ.cm)、純度級別較高的試劑和色譜級溶劑配制流動相；
?、?配好的流動相一定要抽濾脫氣，即便儀器有在線脫氣裝置，也可以在上機前進行抽濾。真空抽濾既過濾顆粒也脫了氣泡，非常有效。
?、?泵在起動前一定要通過泄液閥抽凈泵里的空氣。
④ 用緩沖鹽洗脫時，分析結(jié)束后一定要用水沖洗泵和整個流路系統(tǒng)，不要讓腐蝕性溶液滯留泵中，最后用有機溶劑充滿系統(tǒng)。
3、色譜分離柱的使用與維護
在前述儀器工作原理部分，我們已經(jīng)指出，液相色譜儀的分離是在色譜分離柱中實現(xiàn)的。我們目前工作中多采用反相色譜柱，如何保護好分離柱減少柱的污染是延長柱壽命的關(guān)鍵。
3.1怎樣維護好色譜分離柱
加保護柱(預(yù)柱)是保護分離柱的有效辦法。保護柱是根內(nèi)裝填料與分離柱性質(zhì)相近的短柱，接在分離柱之前，或代替流路過濾器。保護柱的作用是收集和阻塞分離柱口的化學(xué)垃圾，這些垃圾如果直接進入分離柱會逐漸堆積在柱頭，最終降低柱效能。保護柱是消耗品，如分析血漿樣品，一般分析50個樣品后需更換新柱芯。
避免高壓沖擊分離柱。一般色譜柱都能承受得起高壓，但經(jīng)不住突然變化的高壓沖擊，這將改變柱床體積，影響柱效。引起高壓沖擊的原因主要有：進樣器的樣品閥的緩慢轉(zhuǎn)動、泵啟動太快、柱切換等操作。用手動進樣閥時的壓力變化不大，自動進樣閥由于切換較慢，可能會造成壓力沖擊。
合理選擇分離柱。我們知道，選擇色譜分離柱主要根據(jù)兩點，一是根據(jù)待測組分的分子量的大??；二是根據(jù)流動相條件，包括PH值、離子強度和溶劑極性等。傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)的鍵合相柱要求流動相PH值在3-7之間，極端PH值(>8)的流動相能溶解硅膠，使鍵合相流失。而目前利用先進的雜化顆粒技術(shù)研制的高純硅膠顆粒填料(如Waters公司的XTerra色譜柱)，集硅膠和多孔聚合物填料的優(yōu)點為一體，使有機硅烷單元取代了相當(dāng)一部分占據(jù)顆粒內(nèi)部和表面位置的硅羥基，使這種新型填料具有分辨率高、穩(wěn)定性強、PH范圍寬(1-12)的優(yōu)勢，其性能突破了傳統(tǒng)高效液相色譜柱的極限。所以一定要根據(jù)分析的對象、流動相的條件選擇合適的分離柱，茫然時可向公司的技術(shù)人員咨詢。
定期沖洗分離柱。每次分析工作結(jié)束時，沖洗完緩沖鹽后，最后要過度到用強溶劑沖洗柱子，如可用色譜純甲醇、乙腈沖洗反相C18柱，目的是沖去吸附在柱上的強保留組分。如果用甲醇/水為流動相也應(yīng)這樣沖洗柱子，在一定程度上可恢復(fù)柱效。
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