1. 色譜柱使用壽命

　　問(wèn)：我的色譜柱僅進(jìn)樣了100針，就出現(xiàn)色譜峰變形、柱效下降，這是為什么?

　　答：僅進(jìn)樣100針確實(shí)是很短的柱壽命。正常情況下，一根色譜柱是可以使用更長(zhǎng)時(shí)間的。為了確定是哪里出了問(wèn)題，我們首先需要確定是否只要你采用該分析方法，柱壽命就是很短。

　　有兩種基本情況：

　　1. 以前有用于該分析方法的色譜柱，其使用壽命都要長(zhǎng)的多;

　　2. 所用用于該分析方法的色譜柱，在使用大致相同的進(jìn)樣針數(shù)后就報(bào)廢了。

　　在第一種情況下，我們需考慮所用分析方法是否真的保持一致。樣品的組成有沒(méi)有改變?樣品中的強(qiáng)保留雜質(zhì)會(huì)使柱效降低。所用儀器通路中的密封件狀態(tài)是否完好?脫落的密封件碎屑可能堵塞柱篩板和柱頭處的填料，從而影響樣品的分配。

　　如果能合理的確定色譜條件沒(méi)有變化，那么你可以認(rèn)為問(wèn)題的原因是填料床的機(jī)械性缺陷。這可能是由于實(shí)驗(yàn)室使用中或運(yùn)輸過(guò)程中對(duì)色譜柱的粗暴處理引起的(您將其掉落了嗎?)，或者是由于制造缺陷引起。此類(lèi)缺陷無(wú)法通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)色譜柱質(zhì)量控制檢測(cè)出來(lái)，只有在使用一段時(shí)間后才能顯示出來(lái)。針對(duì)后一種情況，色譜柱生產(chǎn)廠家將會(huì)為您免費(fèi)更換色譜柱。

　　問(wèn): 這些色譜柱生產(chǎn)廠家很好，但這不是我的問(wèn)題。我的色譜柱使用壽命總是很短，有時(shí)是進(jìn)樣100針，有時(shí)是200針。我可以忍受200次針的使用壽命，但100針的使用壽命是不夠的。而且色譜柱價(jià)格越來(lái)越昂貴。我應(yīng)該怎么辦?

　　答：我100%同意你的看法。我們需要做的就是一起找到導(dǎo)致問(wèn)題的原因，然后看看可以采取什么措施來(lái)解決它。

　　造成上述問(wèn)題最可能的原因是樣品組分被吸附在了色譜柱柱頭部分。它們可能是由于在流動(dòng)相中的低溶解性而析出沉淀，或是被主動(dòng)強(qiáng)吸附。隨著您進(jìn)樣次數(shù)增多，這些污染物會(huì)堆積在色譜柱的頂部，阻礙樣品的正常吸附和分布，從而導(dǎo)致峰形變差。通常，這個(gè)問(wèn)題通常還伴隨著系統(tǒng)壓力的增高。

　　問(wèn)：好的，可能就是如此。那我應(yīng)該如何解決呢?

　　答：有幾種方法可以防止這種情況的發(fā)生。一種是使用合適的樣品制備技術(shù)來(lái)凈化樣品。使用與分離柱化學(xué)性質(zhì)相似的SPE柱進(jìn)行固相萃取可很好地解決此問(wèn)題。

　　另一種也是更有力的方法是使用保護(hù)柱。當(dāng)發(fā)生上述問(wèn)題時(shí)，預(yù)柱就代替了被犧牲的柱頭。為了獲得較佳性能，您應(yīng)使用與分析柱有完全相同填料、并采用了相同高性能填料技術(shù)的保護(hù)柱。如果使用其他品牌填料的預(yù)柱，則在分離效能和保護(hù)分析柱方面都無(wú)法達(dá)到較佳。另外，請(qǐng)勿使用更大粒徑的預(yù)柱，大粒徑或填充不好的預(yù)柱可能由于預(yù)柱中譜帶變寬導(dǎo)致分離效能下降。

　　問(wèn)：使用預(yù)柱聽(tīng)起來(lái)不錯(cuò)。你還有其他解決辦法嗎?

　　答：嗯..也不是能說(shuō)沒(méi)有，還有其他幾種，但他們各有各的缺點(diǎn)。

　　我不主張使用理論上能溶解色譜柱頂部污染物的溶劑進(jìn)行色譜柱“洗滌”。在許多情況下，這根本行不通。例如，如果污染物是沉淀在色譜柱頭部的蛋白質(zhì)，那么當(dāng)您嘗試將其洗掉時(shí)，它們已經(jīng)因變性而大量老化，甚至發(fā)生交聯(lián)以致無(wú)法再次溶解。此外，每次沖洗還會(huì)帶走水解的鍵合相，如果不沖洗該鍵合相應(yīng)該是在發(fā)生水解的位置處保持局部平衡的。因此，重復(fù)清洗實(shí)際上可能導(dǎo)致色譜柱的加速老化。還有，每次沖洗后你還需要用流動(dòng)相對(duì)色譜柱進(jìn)行再平衡，再平衡過(guò)程在部分情況下將會(huì)非常耗時(shí)，如使用離子對(duì)色譜法。

　　經(jīng)常嘗試的另一種方法是反沖色譜柱。如果使用與流動(dòng)相不同的溶劑進(jìn)行沖洗，那么我們反對(duì)的理由就與色譜柱沖洗一樣。如果使用流動(dòng)相沖洗，那么就會(huì)花大量時(shí)間直到污染物被沖洗出來(lái)，也可能甚至根本就沖洗不出來(lái)。同樣，任何的反沖都會(huì)傷害色譜柱。即使今天的色譜柱被填充的足夠好，可以承受反沖，我仍不建議將其作為標(biāo)準(zhǔn)操作。

　　問(wèn)：所以你給出的可以建議就是使用預(yù)柱?

　　答：完全正確。使用預(yù)柱花費(fèi)不大——根據(jù)品牌和類(lèi)型不同，價(jià)格在$10~$50之間——而他們保護(hù)的色譜柱價(jià)格通常是其價(jià)格的10倍。此外，它們還可以保護(hù)您的色譜柱免受其他可能更難追查污染物的侵害。你所提到的色譜柱問(wèn)題的根源還可能是由其他污染物如流動(dòng)相中的灰塵或泵密封墊脫落的碎屑引起。也可能是由流動(dòng)相中的污染物被吸附引起。上述原因中的其中一些可能很難進(jìn)行故障排查，而保護(hù)柱可以很容易的解決這些問(wèn)題。

　　問(wèn)：還有其他原因可能導(dǎo)致色譜柱壽命縮短嗎?

　　答：有，但是如果您遵循制造商的建議，則可能性很小。一種可能的原因是由于流動(dòng)相pH值超出建議范圍而導(dǎo)致色譜柱塌陷。這也可能因樣品溶解在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿溶液中引起的。

　　此外，針對(duì)特定色譜柱，這里還有一些小建議。

　　例如氨基柱會(huì)與醛和酮反應(yīng)。在無(wú)緩沖鹽的水溶液中的氨基柱會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)堿性的pH值，從而導(dǎo)致二氧化硅部分溶解。

　　當(dāng)暴露在錯(cuò)誤的溶劑中時(shí)，色譜柱也會(huì)塌陷。這是因?yàn)樯V柱從根本上來(lái)說(shuō)結(jié)構(gòu)非常松散。它們通過(guò)顆粒彼此粘附而部分聚集在一起。當(dāng)你將它們置于破壞這種粘附力的流動(dòng)相中時(shí)，柱床塌陷的可能性就會(huì)增加。這偶爾會(huì)發(fā)生于在中等極性溶劑中的CN柱或在THF溶劑中的苯基柱上。

　　這也是避免色譜柱“洗滌”的一個(gè)原因。

　　2. 不斷變化的保留時(shí)間

　　問(wèn)：我的色譜峰保留時(shí)間不固定，這是為什么?

　　答：首先，我們需要找到這種變化的模式。這將告訴我們很多有關(guān)該問(wèn)題的潛在根源。如果保留時(shí)間從一次運(yùn)行到下一次運(yùn)行隨機(jī)變化，那么我將首先檢查一下泵和溶劑混合裝置。為驗(yàn)證泵是否正常工作，請(qǐng)使用帶刻度的量筒和秒表來(lái)測(cè)量流速。為了驗(yàn)證流動(dòng)相的組成有無(wú)變化，可以向一種流動(dòng)相溶劑中加入示蹤劑然后觀察基線。如果流動(dòng)相組成恒定，則基線將穩(wěn)定。如果成分發(fā)生變化，您將在基線中觀察到相應(yīng)的變化。例如，如果您使用的是帶紫外檢測(cè)器的反相色譜法，你可以向有機(jī)溶劑中添加0.1%丙酮，并在254 nm處監(jiān)測(cè)基線?；蛘?，您可以手動(dòng)配置流動(dòng)相從而繞過(guò)溶劑混合設(shè)備。如果保留時(shí)間的波動(dòng)消失了，那么問(wèn)題的根源就是混合設(shè)備。

　　問(wèn)：同一天不同針之間的保留時(shí)間很穩(wěn)定，但是不同天之間的保留時(shí)間不固定。

　　答：在這種情況下，儀器本身不太可能是罪魁禍?zhǔn)?。引起這種變化的最可能原因是流動(dòng)相組成。在反相色譜中，保留因子k與流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)之間存在指數(shù)關(guān)系。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，如果有機(jī)溶劑的用量誤差為1%，則保留時(shí)間可在5%至15%之間變化，通常約為10%。這意味著您必須非常仔細(xì)地測(cè)量溶劑的量?？梢缘姆椒ㄊ前粗亓慷皇前大w積制備流動(dòng)相。

　　另外，如何給流動(dòng)相脫氣也可能導(dǎo)致保留時(shí)間變化?？梢缘拿摎夥椒ㄊ峭瑫r(shí)采用真空和超聲約一分鐘。另一種好的方法是氦氣吹掃。在流動(dòng)相與氦氣達(dá)到初步平衡后，應(yīng)將氦氣流量調(diào)低。否則，氦氣將攜帶溶劑蒸氣，而流動(dòng)相溶劑組成可能會(huì)因此蒸發(fā)而發(fā)生變化。

　　如果您的樣品成分是離子型或可離子化的，那么控制流動(dòng)相的pH值就非常重要。小至0.1pH單位的變化都可能導(dǎo)致保留時(shí)間10%的偏移。因此，準(zhǔn)確測(cè)量pH值并維持pH計(jì)校準(zhǔn)良好非常重要。在反相系統(tǒng)中，隨著pH值的增加，酸的保留時(shí)間縮短，而堿的保留時(shí)間延長(zhǎng)。

　　順便說(shuō)一句，我的化學(xué)老師總是說(shuō)：“緩沖液之所以稱(chēng)為緩沖液，是因?yàn)樗鼞?yīng)該緩沖pH值。如果不這樣做，就不是緩沖液?！崩纾宜徜@溶液就是乙酸銨溶液。乙酸鹽緩沖液包含乙酸根離子和乙酸。如果緩沖液中它們的存在量相同，則所得的pH值就是緩沖液的pKa值，以乙酸鹽為例其pKa值為4.75。緩沖液總是在溶液pH=pKa時(shí)，緩沖能力較強(qiáng)。

　　問(wèn)：過(guò)去，我沒(méi)有意識(shí)到需要多么精確地控制流動(dòng)相組成才能獲得可重現(xiàn)的結(jié)果。還有其他必須注意的變量嗎?

　　答：另一個(gè)重要因素是溫度。如果所有峰的保留時(shí)間沿同一方向移動(dòng)，你就可以懷疑是溫度是引起這種波動(dòng)的原因。經(jīng)驗(yàn)告訴我們，溫度每變化每1攝氏度，保留時(shí)間將變化約1%至2%。在正常情況下，這變化并不顯著。但在許多地方，周末會(huì)關(guān)閉暖氣或空調(diào)，然后你就會(huì)疑惑為什么在周末自動(dòng)運(yùn)行的分析顯示的保留時(shí)間與在工作日時(shí)運(yùn)行的分析的保留時(shí)間不同。顯然，通過(guò)使用柱溫箱可有效避免這種情況發(fā)生。

　　在檢測(cè)離子型或可電離樣品化合物的反相色譜法中，保留時(shí)間還受到緩沖液離子強(qiáng)度的影響，但影響很小，通?？梢院雎圆挥?jì)。通常20%摩爾濃度的緩沖液變化對(duì)保留時(shí)間的影響在在1%以下。因?yàn)榭偸菍?duì)緩沖鹽進(jìn)行稱(chēng)重后配置緩沖液，因此不可能發(fā)生如此大的錯(cuò)誤。

　　問(wèn)：還有需要考慮其他參數(shù)的特殊情況嗎?

　　答：是的。在離子對(duì)色譜中，離子對(duì)試劑的濃度會(huì)影響離子樣品組分的保留。與離子對(duì)試劑帶相反電荷的分析物的保留時(shí)間增加，帶相同電荷的分析物的保留時(shí)間減少。中性化合物幾乎不受影響。當(dāng)離子對(duì)試劑濃度低時(shí)，即低于5 mM/L，與試劑相互作用的樣品成分的保留時(shí)間會(huì)隨離子對(duì)試劑濃度的變化成比例地變化。當(dāng)離子對(duì)試劑濃度高時(shí)，即大約10 mM/L，基團(tuán)表面被離子對(duì)試劑吸附飽和，此時(shí)離子對(duì)試劑濃度的變化不會(huì)導(dǎo)致分析物的保留時(shí)間發(fā)生明顯變化。

　　在正相色譜中，保留時(shí)間對(duì)流動(dòng)相中極性成分的濃度非常敏感。無(wú)論是否想要，這些成分中總是存在的一種是水。因此，水分含量的不同就可能導(dǎo)致保留時(shí)間的不同。解決該問(wèn)題的一種訣竅是使用用水半飽和過(guò)的非極性溶劑，如己烷或二氯甲烷。為此，您需要取一定量的此溶劑并通過(guò)向其中添加一些水再攪拌一會(huì)兒使其飽和，，然后將這種水飽和的溶劑混勻后與等體積的“干燥”溶劑混合。該么操作的結(jié)果是非極性溶劑的水含量具有相當(dāng)好的重現(xiàn)性。它還有助于防止保留時(shí)間的漂移，但這是后面部分的主題。

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