甘草為豆科植物甘草、脹果甘草或光果甘草的干燥根及根莖，始載于《本經(jīng)》，藥用歷史悠久。其功能補脾益氣、潤肺止咳、緩急止痛、清熱解毒、緩和藥性。主要含有甘草酸及甘草苷類成分，其中甘草酸為現(xiàn)代藥理應(yīng)用研究證實具有抗纖維化、抗炎、抗病毒和保肝解毒及增強免疫功能等作用。目前針對甘草的內(nèi)在質(zhì)量控制，主要圍繞甘草酸成分進行定性、定量一類的檢查。2005版《中國藥典》收載了RP-HPLC 三元等度洗脫法測定甘草酸的方法，規(guī)定甘草酸含量不得低于2%。本實驗依托2005版《中國藥典》一部甘草酸含量測定（附錄VID）項下操作主線，采用RP-HPLC法測定甘草酸的含量，方法簡便、快速，重現(xiàn)性好，結(jié)果穩(wěn)定，用于甘草酸的檢測專屬性強，杭州賽析科技有限公司根據(jù)藥典推出了501液相色譜儀用于甘草酸檢測。效果理想，得到客戶的認可，在中藥飲片檢測中起到重要作用。
儀器：
501液相色譜儀（配UV501檢測器）、N2000色譜工作站、7725i手動進樣閥
色譜條件
色譜柱：美國ZORBAX Exund C18分析柱（4.6mm×250mm,5μm）為固定相；
流動相：甲醇-0.2mol/L醋酸銨溶液-冰醋酸（67∶33∶1）為流動相；
檢測波長：250nm；
流速1ml·min-1；
柱溫：室溫。
柱效以甘草酸計，理論塔板數(shù)不應(yīng)低于2000。
結(jié)果被測成分于7min 內(nèi)即可出完，等度洗脫全程為0～20min。
2.2 對照品溶液的制備
精密稱取80℃干燥至恒重的甘草酸單銨鹽0.1g對照品，置100ml量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，使成每ml含有甘草酸單銨鹽1 mg對照品溶液。
2.3 供試品溶液的制備
取甘草，研細（過3號篩），置烘箱內(nèi)80℃干燥至恒重，精密稱取0.3g，置100ml量瓶中，加流動相約45ml，超聲處理（功率250W，頻率20KH2）30min，取出，放冷，加流動相至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。
2.4 測定方法
精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以對照品溶液色譜圖中甘草酸的峰面積（3次平均）外標(biāo)法計算甘草中甘草酸的含量（%，W/W）。
2.5 線性關(guān)系
精密吸取對照品溶液1.0、2.0、4.0、8.0、10.0ml于100ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，分別進樣10μl，記錄峰面積。以進樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積(A)為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準曲線。甘草酸回歸方程為Y=3.00029X+1.23099 r=0.99989，線性范圍0.1033～1.0330μg。
2.6 精密度試驗
精密吸取供試品溶液與上述色譜條件下進樣10μl，重復(fù)5次，以被測成分峰面積分別計算，結(jié)果甘草酸 RSD=1.21%。
2.7 穩(wěn)定性試驗
精密吸取供試品溶液10μl，分別于0、2、4，6、8h進樣，記錄峰面積，結(jié)果甘草酸 RSD=1.45%。(n=5)。
2.8 重現(xiàn)性試驗
取同一批次甘草藥材按2.3項下提取制備5份供試溶液，分別精密吸取10μl進樣，記錄峰面積，結(jié)果甘草酸 RSD=1.32%。
2.9 回收率測定
取已知含量的甘草樣品粉末約0.2g，精密稱定9份，置10ml的量瓶中，樣本中添加1mg/ml甘草酸對照品溶液1ml，按2.3項下操作，進樣10μl，依2.4法測定, 記錄峰面積并計算回收率，甘草酸平均回收率為99.04% RSD=0.79%，結(jié)果見表1。表1 甘草酸加樣回收率實驗結(jié)果（略）
2.10 樣品測定
取6批樣品，按2.3項下提取制備，依2.4項方法測定，重復(fù)測定3次，結(jié)果生藥甘草的平均含量為7.85% RSD=0.85%。
3 討論
3.1 洗脫溶劑系統(tǒng)的選擇
本實驗為RP-HPLC 三元等度洗脫法。選擇甲醇-0.2mol/L醋酸銨溶液-冰醋酸（67：33：1）作為洗脫溶劑，是基于甘草酸對三元等度洗脫系統(tǒng)的適應(yīng)性的考量。脹果甘草中含有甘草酸、甘草苷等成分，因此只要選擇適宜的洗脫溶劑系統(tǒng)，以促使各組分的分配系數(shù)較大，達到基線分離的效果。實驗證明該方法簡單、易行，設(shè)備要求相較梯度洗脫為低，早期一類設(shè)備都可用于檢測，且抗干擾性強，具有專屬性特點。
3.2 關(guān)于甘草酸
由生藥甘草中提取的甘草酸，通常稱之天然甘草酸，天然甘草酸存在順反異構(gòu)，且以順式甘草酸含量為高，反式甘草酸含量極低。本實驗未能揭示該異構(gòu)體基線分離，可能與該異構(gòu)體化學(xué)結(jié)構(gòu)相似抑或是脹果甘草本身未含有反式甘草酸有關(guān)，尚待進一步研究。
相關(guān)鏈接：甘草及甘草酸液相色譜儀檢測方法 中藥飲片檢測液相色譜儀
中低壓液相色譜柱系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相,被流動相載入中低壓液相色譜柱內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),在兩相中作相對運動時,經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出,通過檢測器時,樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來中低壓液相色譜柱主要有進樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。
中低壓液相色譜柱的保護：
1、流動相和樣液都需用0.45um孔徑的濾膜過濾。
2、加3～5cm保護柱。
3、進樣閥進樣。
4、用純甲醇保存色譜柱，防止細菌生長。
5、防止過酸或過堿。
6、防止振動和逆向流動。
7、對硅膠基鍵合相，水溶液流動相的ph值不得超出2～8.5的范圍，使用溫度不宜過高。
8、中低壓液相色譜柱在酸性或堿性條件下使用后，應(yīng)依次用水和甲醇清洗。對暫時不用而需要較長時間保存的色譜柱，要用純甲醇清洗。
9、中低壓液相色譜柱兩端用金屬螺帽封閉，保存在干凈的有機溶劑中。
中低壓液相色譜柱的再生：
一般情況下，硅膠和ods等化學(xué)鍵合固定相再生是困難的。有時采用下述方法可能提高柱效。
1、由于雜質(zhì)微粒等因素，使色譜柱上端固定相變色，柱效下降。這時，可仔細地將變色部分除去約3mm左右，再補充新的固定相。
2、當(dāng)色譜柱吸附未被洗脫的成分時，柱效將明顯下降，可選擇合適的溶劑洗凈。
3、當(dāng)采用梯度洗脫時，色譜柱在重復(fù)使用前，用泵把幾倍于柱體積的起始溶劑壓經(jīng)色譜柱，以重新建立起始的平衡來得到再生。
①樣品體積過大--用流動相配樣,總的樣品體積小于第—峰的15% ②樣品溶劑過強--采用較弱的樣品溶劑 ③柱塌陷或形成短路通道--更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件 ④柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效--更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品 ⑤進樣器損壞--更換進樣器轉(zhuǎn)子
449717568
