高效液相色譜法測(cè)定連翹中連翹苷的含量
連翹系木樨科植物連翹Forsythiae suspensa(Thunb.)Vahl.的干燥果實(shí)。按采收時(shí)期不同，分青翹、老翹［1］兩種。連翹為傳統(tǒng)常用中藥，含有大量的木脂素類［2～4］成分，測(cè)定方法雖有一些報(bào)道［5，6］，但無(wú)法定檢驗(yàn)方法。本文建立了HPLC法測(cè)定連翹的有效成分之一連翹苷的含量，經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)，優(yōu)化了提取分離方法及色譜測(cè)定條件，方法學(xué)考察表明，該法簡(jiǎn)便易行，重現(xiàn)性好。
1 儀器與試藥
島津LC—6A輸液泵，SPD—6AV檢測(cè)器，C—R3A數(shù)字處理機(jī)；島津LC—10AD輸液泵，SPD—10A二極管陣列檢測(cè)器，CLASS—10A色譜工作站；連翹苷對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；連翹藥材：山西省藥檢所提供及河北安國(guó)藥市購(gòu)買，由中國(guó)藥品生物制品檢定所中藥室鑒定。甲醇、乙腈等試劑均為分析純。
2 色譜條件
色譜柱：Axxiom-ODS(4.6mm×25cm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；流動(dòng)相：乙腈—水(25∶75)；流速：0.8mL/min。理論板數(shù)以連翹苷計(jì)為5000。樣品分離色譜圖見(jiàn)圖1。
3 色譜峰紫外光譜一致性比較
樣品中所測(cè)成分色譜峰與連翹苷對(duì)照品色譜峰200～400nm紫外光譜比較，相似度(Similarity)為1.00(見(jiàn)圖2)。
4 溶液的制備
4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥48h的連翹苷對(duì)照品適量，加甲醇制成0.25mg/mL的溶液。
圖1 對(duì)照品(A)與樣品(B)HPLC色譜圖
1.連翹苷
圖2 樣品測(cè)定成分與對(duì)照品色譜峰紫外光譜
1.連翹苷 2.樣品
4.2 供試品溶液的制備 精密稱取連翹粉末約1g，精密加入甲醇15mL，密塞，稱定重量，冷浸過(guò)夜。超聲處理25min，放至室溫，補(bǔ)足失重，濾過(guò)。精密吸取續(xù)濾液5mL，水浴蒸至約0.5mL，加中性氧化鋁0.5g拌樣后，蒸干，加于已處理好的中性氧化鋁柱(100～120目，1g，內(nèi)徑10～15mm)上，用70%乙醇80mL洗脫，收集洗脫液，置水浴上蒸干，用50%甲醇溶解，并轉(zhuǎn)入5mL量瓶中，定容，搖勻，過(guò)0.5μm微孔濾膜，濾液作為供試品溶液。
5 線性關(guān)系的考察
分別配制連翹苷對(duì)照品濃度為0.098、0.197、0.288、0.393、0.501mg/mL的甲醇溶液，各精密吸取5μL注入液相色譜儀，測(cè)定。以連翹苷進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程為：
Y＝91239.1X-1054.9 r＝0.9995
結(jié)果表明：連翹苷在0.5～2.5μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
6 精密度與重復(fù)性試驗(yàn)
精密吸取對(duì)照品溶液6μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得平均峰面積積分值為136648，RSD為0.4%，n=6；按供試品溶液制備方法處理同一批樣品5份，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果連翹苷平均含量為4.23mg/g，RSD為1.8%，n=5。
7 加樣回收率試驗(yàn)
精密稱取已知含量的樣品5份，每份0.5g，分別精密加入0.4164mg/mL連翹苷對(duì)照品甲醇溶液5mL，精密加入甲醇10mL，按與供試品溶液制備相同的方法進(jìn)行處理，同項(xiàng)“6”法進(jìn)樣測(cè)定、計(jì)算，結(jié)果平均回收率為99.53%，RSD=1.06%(n=5)。
8 樣品測(cè)定
取不同來(lái)源的連翹藥材，按供試品溶液制備方法處理，同項(xiàng)“6”方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 樣品測(cè)定結(jié)果
來(lái)源
含量(mg/g)
青翹
安國(guó)藥市1
2.30
安國(guó)藥市2
5.25
山西沁源
4.23
老翹
山西安澤
0.15
河南洛陽(yáng)
1.59
安國(guó)藥市
1.64
全屏顯示表格9 討論
9.1 樣品制備曾采用加水沉淀法，以去除其它成分的干擾，但結(jié)果不甚理想，采用吸附柱層析法則大大提高了供試品溶液的純凈度。通過(guò)對(duì)氧化鋁、氧化鎂、大孔吸附樹(shù)脂等柱的凈化效果的比較，從中篩選出中性氧化鋁柱；經(jīng)對(duì)不同濃度的甲醇、乙醇溶液的洗脫效果作比較，結(jié)果以70%乙醇溶液為較佳。
9.2 曾選用甲醇—水(35∶65)、加入少量四氫呋喃作流動(dòng)相，結(jié)果峰形不甚理想，采用乙腈—水后可有效地改善峰形，而且乙腈濃度的變化可明顯影響連翹苷的保留時(shí)間。
9.3 樣品測(cè)定結(jié)果表明：不同來(lái)源的連翹藥材的連翹苷含量相差較大，而青翹中的連翹苷含量相對(duì)較高。
參考文獻(xiàn)
1 中國(guó)藥典.1995.一部：145
2 林啟壽.中草藥成分化學(xué).北京：科學(xué)出版社，1977.115，345
3 千葉真理子等.漢藥レンギョウの成分研究(第3報(bào))シナレンギョウおよびレンギョウ果實(shí)の成分について，生藥學(xué)雜藥學(xué)1978，32(3)：194
4 西部三省等.漢方藥レンギョウの成分研究(第2報(bào)).第九改正日本藥局方レンギョウ基原植物の果實(shí)におけるリグナン配糖體成分の比較，藥學(xué)雜志，1977，97(10)：1134
5 梁文藻等.連翹成分分析Ⅰ.連翹甙和連翹脂素的分離鑒定和測(cè)定.藥物分析雜志，1985，5(1)：1
6 崔燕巖等.連翹有效成分的HPLC法測(cè)定.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1992，27(8)：603
相關(guān)鏈接：連翹液相色譜儀 高效液相色譜法測(cè)定腎炎解熱片中連翹苷的含量 高效液相色譜法測(cè)定四季感冒片中連翹苷含量
高效液相色譜儀色譜柱在色譜分析系統(tǒng)中主要起著分離檢測(cè)物質(zhì)的作用，如同色譜系統(tǒng)的心臟，同時(shí)也是易損耗品。什么情況下會(huì)導(dǎo)致液相色譜柱柱效降低甚至“失效”。
1、篩板堵塞
色譜柱入口篩板堵塞是較為常見(jiàn)的問(wèn)題之一，會(huì)導(dǎo)致柱壓升高、色譜峰拖尾、塔板數(shù)降低等問(wèn)題。通常分析樣品中微粒雜質(zhì)最右可能堵塞色譜柱入口，因此分析時(shí)，需要先過(guò)濾或者離心，乳濁或渾濁樣品應(yīng)以0.25?m濾膜處理，也可用針頭過(guò)濾器過(guò)濾。進(jìn)樣器與泵密封墊的磨損也會(huì)帶入微粒，在進(jìn)樣閥與色譜柱之間使用0.25?m或0.45?m的在線過(guò)濾器，通?？梢员苊膺@類問(wèn)題
2、強(qiáng)保留樣品組分
強(qiáng)吸附性的樣品組分吸附在柱頭填料上，能嚴(yán)重地影響色譜柱壽命。像生物組織或體液的提取物、天然產(chǎn)物等復(fù)雜樣品，極易造成柱頭的污染。相對(duì)較純的樣品，一般不會(huì)出現(xiàn)這一問(wèn)題。色譜柱應(yīng)用中，色譜峰嚴(yán)重拖尾或分裂往往是強(qiáng)保留污染物在柱頭吸附的體現(xiàn)。
3、色譜柱裝填不良
裝填不良的色譜柱，在短時(shí)間應(yīng)用后，填充床的壓縮通常使柱頭處產(chǎn)生塌陷，導(dǎo)致柱效突然降低。色譜柱的初始評(píng)價(jià)指標(biāo)，如塔板數(shù)、不對(duì)稱因子等往往不能很好地表征色譜柱床層的穩(wěn)定性，這種情緒只能在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)。
4、壓力因素
液相色譜儀色譜柱使用過(guò)程中的驟然壓力波動(dòng)、機(jī)械撞擊或溫度驟然變化都會(huì)對(duì)色譜柱床層產(chǎn)生影響，導(dǎo)致峰形變差和柱效降低。進(jìn)樣過(guò)程中，進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)動(dòng)太慢可引起壓力波動(dòng)，使色譜柱床產(chǎn)生裂隙，在柱切換時(shí)也存在同樣的問(wèn)題。使用填充良好的色譜柱，在較低柱壓下操作，可大大減少由壓力波動(dòng)造成的色譜柱損壞。
有些色譜柱廠家建議在使用液相色譜柱時(shí)加入保護(hù)柱，保護(hù)柱是收集、阻斷來(lái)自進(jìn)樣器的機(jī)械和化學(xué)雜質(zhì)，以保護(hù)和延長(zhǎng)分析柱的使用壽命。
柱子的再生
色譜柱屬于色譜分析的常用消耗品，它是有壽命的；但它壽命的長(zhǎng)短與我們的樣品處理程度、有無(wú)加保護(hù)柱以及清洗是否恰當(dāng)和徹底緊密相關(guān)！當(dāng)柱子在使用一段時(shí)間以后，它的柱壓可能升高，柱效可能降低，這時(shí)如果我們對(duì)柱子進(jìn)行再生，它的壽命也許會(huì)得到一定的延長(zhǎng)。
柱子使用
1、首先要確認(rèn)您所要分析的樣品流動(dòng)相的pH范圍是否在您的柱子的pH范圍之內(nèi)，以免損壞柱子硅膠！
2、接下來(lái)就是用你做樣品的流動(dòng)相去平衡柱子，如果您的流動(dòng)相中含有緩沖鹽溶液，在平衡柱子之前務(wù)必要先用5％的甲醇(乙腈)/水去過(guò)渡10倍柱體積(150x4.6mm柱子約為30ml，250x4.6mm柱子約為45ml；下同)以上，再用帶鹽的流動(dòng)相去平衡柱子足夠的時(shí)間(直到基線非常平穩(wěn)為止)，之后方可進(jìn)樣分析。
3、無(wú)論您分析何種樣品，都會(huì)由于各種原因樣品中總有部分雜質(zhì)，因此建議您在進(jìn)樣前在柱子前端加接保護(hù)柱以保護(hù)您那昂貴的分析柱，或者用0.2um或 0.45um針頭過(guò)濾器過(guò)濾樣品后方進(jìn)樣分析！
1 高效液相色譜儀系統(tǒng)
液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進(jìn)樣器、柱子、柱溫箱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。對(duì)于整個(gè)系統(tǒng)而言，柱子、泵和檢測(cè)器是核心部件同時(shí)也是易出問(wèn)題的主要部位。
2 常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法
高效液相作為一種高精密儀器，如果在使用過(guò)程中不按照正確操作的話，就容易導(dǎo)致一些問(wèn)題。其中常見(jiàn)的就是柱壓?jiǎn)栴}、漂移問(wèn)題、峰型異常問(wèn)題。
1.柱壓?jiǎn)栴} 柱壓?jiǎn)栴}是使用高效液相色譜過(guò)程中需要密切注意的地方，柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時(shí)間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個(gè)恒定值而是指壓力波動(dòng)范圍在50PSI（3.3 Bar）之間（在使用梯度洗脫時(shí)，柱壓平穩(wěn)緩慢的變化是允許的）。壓力過(guò)高、過(guò)低都屬于柱壓?jiǎn)栴}。
壓力過(guò)高：這是高效液相在使用中常見(jiàn)的問(wèn)題，指的是壓力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時(shí)，我們應(yīng)該分段進(jìn)行檢查。
(1) .首先斷開(kāi)真空泵的入口處，此時(shí)PEEK管里充滿液體，使PEEK管低于溶劑瓶，看液體是否自由滴下，如果液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過(guò)濾頭堵塞。處理方法：用30%的硝酸浸泡半個(gè)小時(shí)，在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下，溶劑過(guò)濾頭正常，在檢查；
(2).打開(kāi)Purge閥，使流動(dòng)相不經(jīng)過(guò)柱子，如果壓力沒(méi)有明顯下降，則是過(guò)濾白頭堵塞。處理方法：將過(guò)濾白頭取出，用10%的異丙醇超聲半個(gè)小時(shí)。如果壓力降至100PSI (6.7 Bar)以下，過(guò)濾白頭正常，在檢查；
(3).把色譜柱出口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。處理方法：如果是緩沖鹽堵塞，則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強(qiáng)保留的物質(zhì)導(dǎo)致堵塞，則要用比現(xiàn)在流動(dòng)相更強(qiáng)的流動(dòng)相沖至壓力正常。假如按上面的方法長(zhǎng)時(shí)間沖洗壓力都不下降，則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過(guò)來(lái)接在儀器上，用流動(dòng)相沖洗柱子。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，只有換柱子入口篩板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以盡量少用。
壓力過(guò)低：壓力過(guò)低的現(xiàn)象一般是由于系統(tǒng)泄漏，處理方法：尋找各個(gè)接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋緊即可。當(dāng)然還有一個(gè)原因就是泵里進(jìn)了空氣，但此時(shí)表現(xiàn)的往往是壓力不穩(wěn)，忽高忽低，更嚴(yán)重一點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致泵無(wú)法吸上液體。處理方法：打開(kāi)Purge閥，用3~5ml/min的流速?zèng)_洗，如果不行，則要用專用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。
2.漂移問(wèn)題 主要包括基線漂移和保留時(shí)間漂移。
2.2.1基線漂移一般說(shuō)來(lái)，機(jī)器剛起動(dòng)時(shí)，基線容易漂移，大概要半個(gè)小時(shí)的平衡時(shí)間，如果你用了緩沖溶液或緩沖鹽，還有就是在低波長(zhǎng)下（220nm）平衡時(shí)間相對(duì)會(huì)比較長(zhǎng)，但如果你在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)基線漂移，則你要考慮下面的原因：
1、柱溫波動(dòng)。解決方法：控制好柱子和流動(dòng)相的溫度，檢查是否有打開(kāi)的窗戶或空調(diào)對(duì)著柱溫箱。
2、流通池被污染或有氣體。 解決方法：用甲醇或其他強(qiáng)極性溶劑沖洗流通池（最hao斷開(kāi)柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用鹽酸）。
3、紫外燈能量不足。解決方法：更換新的紫外燈
4、流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成。解決方法：檢查流動(dòng)相的組成，使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級(jí)的溶劑。
5、樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)（高K’值）以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現(xiàn)出一個(gè)逐步升高的基線。解決方法：使用保護(hù)柱，如有必要，在進(jìn)樣之間。在分析過(guò)程中，定期用強(qiáng)溶劑沖洗柱子。
6、檢測(cè)器沒(méi)有設(shè)定在最大吸收波長(zhǎng)處。解決方法：將波長(zhǎng)調(diào)整至最大吸收波長(zhǎng)處
7、流動(dòng)相的PH值沒(méi)有調(diào)節(jié)好。解決方法：加適量的酸或堿調(diào)至最haoPH值
二、.
保留時(shí)間漂移保留時(shí)間重現(xiàn)是液相性能好壞的一個(gè)重要標(biāo)志，同一種東西，兩次的保留時(shí)間相差不要超過(guò)15s，超過(guò)了半分鐘可看做保留時(shí)間漂移，就無(wú)法進(jìn)行定性，你要考慮以下原因：
1、溫控不當(dāng)。解決方法：調(diào)好柱溫，檢查是否有打開(kāi)的窗戶或空調(diào)對(duì)著柱溫箱。
2、流動(dòng)相比例變化。解決方法：檢查四元泵的比例閥是否有故障
3、色譜柱沒(méi)有平衡。解決方法：在每一次運(yùn)行之前給予足夠的時(shí)間平衡色譜柱
4、流速變化。解決方法：重新設(shè)定流速
5、泵中有氣泡。解決方法：、從泵中除去氣泡
2.3 峰型異常問(wèn)題 峰型問(wèn)題是液相的主要問(wèn)題，在做液相過(guò)程中，我們就是要變換不同的條件來(lái)改善不好的峰型，對(duì)于各種各樣的異常峰，要區(qū)別對(duì)待，從主要問(wèn)題出發(fā)，一個(gè)一個(gè)加以解決。
1、色譜圖中未出峰。解決方法：系統(tǒng)未進(jìn)樣或樣品分解；泵未輸液或流動(dòng)相使用不正確；檢測(cè)器設(shè)置不正確；針對(duì)以上情況成因作相應(yīng)調(diào)整即可。
2、 一個(gè)峰或幾個(gè)峰是負(fù)峰。解決方法：流動(dòng)相吸收本底高；進(jìn)樣過(guò)程中進(jìn)入空氣；樣品組分的吸收低于流動(dòng)相。
3、 所有峰均為負(fù)峰。解決方法：信號(hào)電纜接反或檢測(cè)器輸出極性設(shè)置顛倒；光學(xué)裝置尚未達(dá)到平衡。
4、所有峰均為寬峰。解決方法：系統(tǒng)未達(dá)到平衡；溶解樣品的溶劑極性比流動(dòng)相差很多；色譜柱尺寸及類型選擇不正確；色譜柱或保護(hù)柱被污染或柱效降低；溫度變化造成的影響。 、
5、所出峰比預(yù)想的小。解決方法：樣品黏度過(guò)大；進(jìn)樣品故障或進(jìn)樣體積誤差；檢測(cè)器設(shè)置不正確．定量環(huán)體積不正確；檢測(cè)池污染；檢測(cè)器燈出現(xiàn)問(wèn)題。
6、出現(xiàn)雙峰或肩峰。解決方法：進(jìn)樣量過(guò)大；樣品濃度過(guò)高；保護(hù)柱或色譜柱柱頭堵塞；保護(hù)拄或色譜柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。
7、前伸峰。解決方法：進(jìn)樣量或樣品濃度高；溶解樣品的溶劑較流動(dòng)相極性強(qiáng)；保護(hù)柱或色譜柱污染或失效。
8、拖尾峰。解決方法：柱超載，降低樣品量；增加柱直徑采用較高容量的固定相；峰干擾，對(duì)樣品進(jìn)行清潔過(guò)濾；調(diào)整流動(dòng)相；硅羥基作用，加入三乙胺，用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相pH值；柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效，更換燒結(jié)不銹鋼；加在線過(guò)濾器，對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾；死體積或柱外體積過(guò)大，將連接點(diǎn)降至最低；盡可能使用內(nèi)徑較細(xì)的連接管；柱效下降，更換柱子；采用保護(hù)柱，對(duì)柱子進(jìn)行再生。
9、出現(xiàn)平頭峰。解決方法：檢測(cè)器設(shè)置不正確；進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高。
10、出現(xiàn)鬼峰。解決方法：進(jìn)樣閥殘余峰，在每次進(jìn)完樣后用充足的時(shí)間來(lái)平衡和清洗系統(tǒng)；樣品中存在未知物，改進(jìn)樣品的預(yù)處理；流動(dòng)相污染，更換新流動(dòng)相，盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用，隔夜的流動(dòng)相再次使用時(shí)要過(guò)濾；盡可能使用HPLC級(jí)試劑；流路中有小的氣泡，打開(kāi)Purge閥，加大流速排除。
3 結(jié)語(yǔ)
以上內(nèi)容只是對(duì)液相色譜中出現(xiàn)的常見(jiàn)的問(wèn)題進(jìn)行了分析，在故障排除時(shí)要遵守以下原則：一次只改變一個(gè)因素，確定假定因素與問(wèn)題之間的聯(lián)系；如果通過(guò)更換組件來(lái)排查故障時(shí)要注意將拆下的完好組件裝回原位，避免浪費(fèi)；這是成功進(jìn)行故障排除的關(guān)鍵。總之，在使用高效液相色譜時(shí)一定要注意樣品的前處理與儀器的正確操作和保養(yǎng)。
449717568
