色譜柱可分為填充柱和開管柱兩大類。多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤管形、U形管等形狀。
液相色譜通常均采用填充柱。色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相,以及色譜柱的制備和操作條件。
硅膠色譜柱使用方法
稱量。
200-300目硅膠,稱30-70倍于上樣量;如果極難分,也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右,所以要稱40g硅膠,用燒杯量100ml也可以。
2.攪成勻漿。
加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分?jǐn)嚢?。如果洗脫劑是石油?乙酸乙酯/丙酮體系,就用石油醚拌。
3.裝柱。
將柱底用棉花塞緊,不必用海沙,加入約1/3體積石油醚,裝上蓄液球,打開柱下活塞,將勻漿一次傾入蓄液球內(nèi)。隨著沉降,會有一些硅膠沾在蓄液球內(nèi),用石油醚將其沖入柱中。
4.壓實。
沉降完成后,加入更多的石油醚,用雙聯(lián)球或氣泵加壓,直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。
無論走常壓柱或加壓柱,都應(yīng)進行這一步,可使分離度提高很多,且可以避免過柱時由于柱床萎縮產(chǎn)生開裂。
5.上樣。
干法濕法都可以。海沙是沒必要的。上樣后,加入一些洗脫劑,再將一團脫脂棉塞至接近硅膠表面。
然后就可以放心地加入大量洗脫劑,而不會沖壞硅膠表面。
6.過柱和收集。
柱層析實際上是在擴散和分離之間的權(quán)衡。太低的洗脫強度并不好,推薦用梯度洗脫。
收集的例子:10mg上樣量,1g硅膠H,0.5ml收一餾分;1-2g上樣量,50g硅膠(200-300目),20-50ml收一餾分。
7.檢測。要更多地使用專用噴顯劑,如果僅用紫外燈,會損失較多產(chǎn)品,紫外的靈敏度一般比噴顯劑低1-2個數(shù)量級。
8.送譜。收集的產(chǎn)品旋干,在送譜前通常需要重結(jié)晶。
如果樣品太少或為液體,可過一小凝膠柱,作為送譜前的最后純化手段??沙渥V1.5ppm左右所謂的“硅膠”峰。
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柱效(columnefficiency),是指色譜柱保留某一化合物而不使其擴散的能力。柱效能是一支色譜柱得到窄譜帶和改善分離的相對能力。
柱效,從名字上理解是色譜柱的分離效果。色譜柱的有效塔板數(shù)越大或有效的塔板高度越低,色譜柱的柱效越好,類似于每個塔板的分離效率相同,有效塔板數(shù)越多,最終得到的物質(zhì)越純。
柱效率是指溶質(zhì)通過色譜柱之后其區(qū)域?qū)挾仍黾恿硕嗌?,它與溶質(zhì)在兩相中的擴散及傳質(zhì)情況有關(guān),這是所謂色譜的動力學(xué)過程。
怎么計算和直觀的提現(xiàn)?
從塔板概念評價柱效
根據(jù)塔板理論,可以計算一根色譜柱所達到的理論塔板數(shù),或表達為每米理論塔板數(shù)n/m。把相當(dāng)于一個理論塔板的柱子長度稱作理論塔板高度H,通常采用有效塔板數(shù)N和有效塔板高度L來表達柱效,W為峰寬,W1/2為半峰寬:
N=16(Tr/W)^2
=5.54(Tr/W(1/2))^2
=L/H
顯然,N值越大,或H值越小,柱效越高。分散效果主要取決于所選擇的固定相。
從柱的算公式上我們可以看出柱效主要跟理論塔板數(shù)和柱長有關(guān)系。我們來解釋一下理論塔板數(shù)。
理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber),N是色譜柱效的參數(shù)之一,用于定量表示色譜柱的分離效率(簡稱柱效)。N取決于固定相的種類、性質(zhì)(粒度、粒徑分布等)、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。如果峰形對稱并符合正態(tài)分布,N可近似表示為:
理論塔板數(shù)=5.54(保留時間/半高峰寬)2(2是平方)
柱效率用理論塔板數(shù)定量地表示:N=16*(t/w)2。其中,t是溶質(zhì)從進樣到最大洗脫峰出現(xiàn)的時間,w為該溶質(zhì)的洗脫峰在基線處的寬度。在一色譜柱中用相同的洗脫條件時候,不同化合物的滯留時間與其洗脫峰寬度之比接近常數(shù)。因此理論塔板數(shù)大的色譜柱效率高。當(dāng)然,N的大小和柱子長度有密切關(guān)系:理論塔板高度H=柱長/N,用H可以衡量單位長度的色譜柱的效率,H越小,則色譜柱效率越高。。。N為常量時,W隨tR成正比例變化。在一張多組分色譜圖上,如果各組份含量相當(dāng),則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬,峰高則逐漸降低。
用半峰寬計算理論塔板數(shù)比用峰寬計算更為方便和常用,因為半峰寬更容易準(zhǔn)確測定,尤其是對稍有拖尾的峰。
N與柱長成正比,柱越長,N越大。用N表示柱效時應(yīng)注明柱長,,如果未注明,則表示柱長為1米時的理論塔板數(shù)。(一般HPLC柱的N在1000以上。)若用調(diào)整保留時間(tR’)計算理論塔板數(shù),所得值稱為有效理論塔板數(shù)(N有效或Neff)=16(tR’/W)
離子色譜柱的柱效一般由硫酸根的理論塔板數(shù)來計,理論塔板數(shù)可以由色譜儀工作站直接讀出,一般離子色譜柱的柱效大于1000個塔板數(shù).
柱效下降會有什么現(xiàn)象?
1.看峰分離度,分離度直接關(guān)系測試結(jié)果準(zhǔn)確性,可以判斷柱效是否下降,柱效下降分離度一般會變差。
2.測定色譜柱的塔板數(shù)來判斷
3.通過壓力變化和出峰時間來判斷,一般柱效下降時伴隨著柱壓的升高和降低,此時出峰的時間也會和之前有很大差異。
4.還可以根據(jù)新的柱子的保留時間判斷,看重復(fù)性,平行性如何.
5.通過譜圖峰型的變化,是否有嚴(yán)重前伸和拖尾現(xiàn)象,如果峰型很差了,柱效已經(jīng)下降了
柱效下降后如何來提高柱效。
離子交換柱長時間在緩沖溶液中使用和進樣,將導(dǎo)致色譜柱離子交換能力下降,.用稀酸緩沖溶液沖洗可以使陽離子柱再生,反之,用稀堿緩沖溶液沖洗可以使陰離子柱再生.另外,還可以選擇能溶解柱內(nèi)污染物的溶劑為流動相做正方向和反方向沖洗.但再生后的色譜柱柱效是不可能恢復(fù)到新柱的水平的.如果柱子裝反了,可以調(diào)回來,但可能會造成柱內(nèi)擔(dān)體塌陷.在不得已的情況下盡量不要反裝色譜柱。
色譜柱是色譜儀器中重要組成部分之一,它是分離不可缺少的一部分。因此不同的樣品分類,用到不同的色譜柱。
色譜柱可簡單分為以下幾類:
a、根據(jù)分離方式分為:
(1)正相色譜柱:SIL--磷脂、NH--糖、維生素E,CN--甾類激素。
(2)反相色譜柱:ODS(C18)、(C8CNTMSPheny1)低分子量化合物。
(3)離子交換色譜柱等。
b、根據(jù)所有的擔(dān)體材料分為三種:
(1)硅膠型:機械強度高,易制成小顆粒,理論塔板數(shù)高。
(2)聚合物型:在廣泛的PH值范圍內(nèi)穩(wěn)定。
(3)羥基磷灰石型:對蛋白質(zhì)等生物高分子樣品有特殊的選擇性。